1. Vi khuẩn gây bệnh côn trùng

Giữa thế kỷ XIX, Louis Pasteur (1822-1895) nghiên cứu thực nghiệm thành công trong phòng chống bệnh tằm gai. Trong quá trình nghiên cứu bệnh gai trên tằm L. Pasteur (1870) đã phát hiện ra vi khuẩn được đặt tên là Bacillus bombyces có „nhân sáng“ trong tế bào. Đây chính là các tinh thể độc có bản chất protein của loài vi khuẩn này với tên gọi chính xác là Bacillus thuringiensis.  Sau này các nhà khoa học đã xác định được vi khuẩn gây bệnh thối ấu trùng ong châu Âu là Bacillus alvei (năm 1885), trên tằm ở Nhật Bản Bacillus sotto  (năm 1901)...    

1. Đặc điểm chung vi khuẩn gây bệnh côn trùng

Là các giống hình thành bào tử (sporeformers) như Bacillus, Clostridium và các giống không thành bào tử (nonsporeformers) như Pseudomonas, Streptococcus, Serratia, Xenorhabdus và Photorhabdus.

Kích thước 1-2 mm (micromet hay 1 phần nghìn milimet), nặng khoảng 1-2 pg (picogam hay 1 phần triệu gam), chỉ có thể nhìn thấy bằng kính hiển vi.

Hình dạng:

Bacillus: Trực khuẩn hình que sinh bào tử, hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc, sản sinh catalaza

Clostridium:  Trực khuẩn hình que sinh bào tử, phần lớn kỵ khí, không sản sinh catalaza

Pseudomonas: Vi khuẩn hình que với 1 hay 1 chùm lông roi ở 1 đầu, có khả năng sinh oxidaza, không lên men ở môi trường Hugh và Leifson

Serratia: Vi khuẩn hình que ngắn, tạo sắc tố màu tỏ tía sẫm không tan trong nước nhưng tan trong cồn

2. Bacillus thuringiensis

Trong các loài vi khuẩn thì loài Bacillus thuringiensis (Bt) được sử dụng nhiều nhất.

Hình thái bào tử: hình que, 3-6 X 0,8-0,9 mm, gram dương (không mất màu nhuộm khi tẩy bằng i ốt hay cồn), đứng riêng rẽ hay thành chuỗi, xung quanh cơ thể có tiêm mao dài 6-8 mm. Trưởng thành mỗi tế bào có 1 bào tử hình trứng và 1 tinh thể độc hình quả trám. Căn cứ vào khả năng hình thành loxitinaza, cấu trúc tinh thể, khả năng gây bệnh cho các loài côn trùng và đặc tính huyết thanh học người ta chia Bt thành các chủng (varieties) khác nhau.

Các chủng quan trọng: Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti) sử dụng  phòng chống (Culex and Aedes). Loài Bacillus sphaericus được sử dụng trong phòng chống muỗi sống trong nước ô nhiễm (Culex, Anopheles, Aedes)

Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis phòng chống (Bọ cánh cứng khoai tây)

3. Độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis:

Dựa vào cơ chế tác động diệt côn trùng người ta xác định được 4 loại độc tố của Bt:

a/ Nội độc tố  endotoxin, còn gọi là tinh thể độc/Crystal - cry I, cry II, cry III, cry IV. Các loại tinh thể này chuyên tính cho các bộ côn trùng khác nhau:

cryI – Chuyên tính bộ Cánh vẩy Lepidoptera

cryII - Chuyên tính bộ Lepidoptera và bộ Hai cánh Diptera

cryIII - Chuyên tính bộ  Cánh cứng Coleoptera

cryIV - Chuyên tính bộ Hai cánh Diptera

Năm 1955, C.L. Hannay và P. C. Fitz James xác định được bản chất protein có liên quan đến độc tính của vi khuẩn. Tinh thể độc có kích thước lớn 1 mm x 0,5 mm chiếm 30% khối lượng khô của vi khuẩn. Tinh thể dễ thấy khi nhuộm bằng dung dịch Fuchsin cacbonic đặc, xanh Victoria, khi đó có màu sẫm còn bào tử không có màu nhưng có mép sáng. Quan sát tốt hơn nếu sử dụng kinh hiển vi đối pha (Phase-contrast microscope).

Tinh thể có hình quả trám như 2 kim tự tháp úp vào nhau, trên bề mặt có các luống nổi lên cách nhau 29 nm.

Bản chất hóa học của tinh thể: Trong tinh thể độc có trên 1 180 loại axit amin, trong đó có 2 loại chiểm tỷ lệ cao nhất là axits glutamic, và axit asparaginic. Trong tinh thể có chứa lượng khá lớn 5 nguyên tố như C, N, H, O, S. Ngoài ra còn chưa lượng nhỏ 19 nguyên tố khác nhưng không có P. Các phân tử có khối lượng lớn (>800.000) có độc tính còn loại có khối lượng nhỏ (10.000<) thì không có độc tính.

Tinh thể độc được coi là 1 loại tiền độc tổ (Protoxin), được hoạt hóa trong ruột côn trùng hình thành nên các phân tử độc tố với khối lượng 50.000.

Tinh thể bền vững với nhiệt độ cao so với độc tố ở dạng hòa tan. Chẳng hạn tinh thể B. thuringiensis var. Sotto ở 650C sau 1 giờ vẫn còn họat tính trong khi ở dạng khác sẽ mất hòan toàn độc tính. Không tan trong dung môi hữu cơ. Gần đây các nhà khoa học Mỹ đã phân lập được 72 chủng Bt trừ sâu non bộ cánh vẩy, trong đó có những chủng có độc lực cao hơn 20 lần thuốc trừ sâu (dẫn theo Phạm Thị Thùy, 2004).

Trong sản xuất, để thu được nhiều tinh thể người ta đã sử dụng các nguyên liệu chứa protein như khô đậu tương, bột cá ... đưa vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn.

Vi khuẩn hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 300C với lượng thông khí lớn. Nhiệt độ 150C trở xuống không hình thành bào tử. Khi bào tử và tinh thể hình thành thì thành tế bào sẽ bị phân giải.

Tác động của tinh thể lên côn trùng là rất phức tạp. Tác động điển hình là làm liệt đường ruột và xoang miệng. Sau khi ăn tinh thể 1-7 giờ tằm dâu (Bombyx mori) bị liệt toàn thân. Các tế bào thượng bì biến đổi. Sau ăn 1 phút, tinh thể đã xuất hiện tại thượng bì ruột giữa sâu xanh bướm cải (P. brassicae). Một số tế bào bị tách rời, biến hình, các chất bên trong chảy ra ngoài màng (như trên sâu đục thân ngô, Ostrinia nubinalis và nhiều loài khác). Làm tăng tính thẩm thấu Kali và đã chứng minh tăng K+ trong máu và bạch huyết là nguyên nhân tê liệt đường ruột và toàn thân tằm dâu. Liều gây chết 50% (LD 50) đối với tằm dâu và bướm cải từ 0,60 – 5 mg/g sâu.

Sự thay đổi tác động của tinh thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Chẳng hạn, bình thường, khi vào ruột trước và ruột giữa, nếu pH cao (>7.0) và cơ thể không có cơ chế giải độc, tinh thể sẽ vỡ ra làm nhiễm độc máu. Hiện tượng thấy phổ biến trên tằm, sâu róm, bướm cải.... Tuy vậy trong nhiều trường hợp khi tinh thể độc vỡ ra, một số loài sâu có cơ chế tự giải độc, ngừng ăn, pH đường ruột giảm xuống, sau một thời gian nhất định đường tiêu hóa được hồi phục. Trong khi đó, nhiều loài côn trùng sản sinh ra men chuyển Protoxin của tinh thể thành độc tố.

Đã ghi nhận trên 200 loài cánh vẩy bị tinh thể độc tấn công mạnh.

Cách đặt tên gene tinh thể của Bacillus thuringiensis (Bt) và phổ tác động trên côn trùng của chúng như sau:

Gene + Protein của chủng Bt như:

cryI CryI kurstaki (HD-1) aizawai sotto Lepidoptera

cryII CryII kurstaki (HD-1) kurstaki (HD-263) Lepidoptera and Diptera (muỗi)

cry IIIA CryIIIA tenebrionis Coleoptera (chrysomelids) cryIIIB CryIIIB japonensis Coleoptera (scarabaeids)

cry IV CryIV israelensis Diptera (muỗi và ruồi đen)

Phổ tác động lên ký chủ chính được ghi thêm bằng chữ La mã. Chẳng hạn, CryI và CryII chỉ protein chuyên cho Lepidoptera và Diptera/Lepidoptera. Còn gene hoặc protein có thể phân biệt bởi chữ cái (cryIA hoặc CryIA) để chỉ sự khác biệt trình tự của amino acid. Sự khác biệt nhỏ được ghi theo các chữ thường, như cryIA(a) hoặc CryIA(a).

Các động vật có vú không bị ngộ độc khi ăn phải tinh thể là do chất Pepsin trong ruột động vật (hoạt động thích hợp khi pH = 2) đã làm mất tính độc của tinh thể vi khuẩn. 

Đã ghi nhận độc lực của Bt đối với kiến và tuyến trùng.

b/ Ngoại độc tố (anpha) exotoxin, còn được gọi là phospholipaza. Thực chất đây là 1 loại men liên quan đến sự phân hủy phospholipit dẫn đến côn trùng chết. Cho đến nay, tác động của độc tố này là ít ỏi, ngoài nhóm ong Tenthredinidae do có độ pH của ruột phù hợp.

c/ Ngoại độc tố (beta) exotoxin, còn gọi là ngoại độc tố bền nhiệt. Chúng có khối lượng phân tử thấp (707-850). Sau 15 phút ở nhiệt độ 1200C vẫn còn hoạt tính. Chúng tác động lên côn trùng làm cản trở việc tổng hợp ARN thông tin. Chúng còn có tác động cộng hưởng với nội độc tố, sau khi nội độc tố phá hủy biểu bì ruột giữa, chúng nhanh chóng xâm nhiễm vào huyết tương và máu đi đến các cơ quan làm thay đổi quá trình trao đổi chất và làm cho côn trùng chóng chết. Pu Zhelong (1994) ghi nhận khả năng mẫn cảm của 34 loài côn trùng đối với  exotoxin.

            d/ Ngoại độc tố (gama) exotoxin, còn gọi là độc tố tan trong nước. Chúng có khối lượng phân tử thấp từ 200-2000, có một số axit amin tự do, tan trong nước, mẫn cảm với ánh sáng và đặc biệt mất hoạt lực trong 15 phút ở nhiệt độ 600C trở lên.

Cho tới nay Bt được sử dụng rất rộng rãi để phòng chóng sâu hại do những ưu điểm như hoạt tính trừ sâu cao, dễ sử dụng và đặc biệt là an toàn nông sản. Tuy vậy, Bt cũng bộ lộ một số điểm yếu như:

-          Kém bền vững so với thuộc trừ sâu hóa học dưới tác động của môi trường

-          Giảm hoạt tính trong nước và trong môi trường hữu cơ do bị hấp phụ

-          Sự gia tăng đáng kể tính kháng Bt của côn trùng hại. Từ năm 1983 đã chứng minh nhiều loài côn trùng kháng được Bt. Khả năng kháng tăng nhanh nếu sử dụng Bt liên tục.

4. Sản xuất chế phẩm Bt

            Có 2 phương pháp sản xuất chế phẩm Bt là lên men xốp và lên men chìm (Phạm Thị Thùy, 2004).

a/ Lên men xốp

            Đây là công nghệ ít được sử dụng hiện nay do hiệu quả thấp và trong quá trình sản xuất hay gặp sự nhiễm tạp.

            Trong công nghệ cần sử dụng các hạt rắn với yêu cầu không hấp thụ dinh dưỡng. Người ta cũng có thể sử dụng các loại hạt làm nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn như cám lúa mì, bột ngô…

b/ Lên men chìm

Hiệu quả cao và có thể sản xuất lượng sinh khối lớn theo yêu cầu.

Các yếu tố quan trong trong công nghệ bao gồm:

-          Chọn lọc chủng Bt chuẩn có các protein độc tố đặc chủng có hoạt tính cao để nhân, căn cứ vào týp huyết thanh

-          Chọn môi trường phù hợp để tạo ra nhiều bào từ và tinh thể độc nhất. Để giảm giá thành, người ta thường sử dụng các phụ phẩm nông nghiệp, công nghiệp chế biến. Việc nghiên cứu sự phù hợp của từng môi trường lên men với từng chủng vi khuẩn được tiến hành chặt chẽ. Thành phần các môi trường lên men của một số nước được trình bày tại bảng 6.2.

Bảng 6.2. Thành phần môi trường lên men được sử dụng để sản xuất Bt của một số nước ((dẫn theo Phạm Thị Thùy, 2004)

Tên nước

Thành phần môi trường

Tác giả

Mêhicô

Rỉ đường, bột đậu tương, bộ ngô, CaC03 + H20

Roldan và CS, 1988

Hàn Quốc

Bột cá, bột đậu tương, cám đỏ, bã vừng, gạo, cám

Yoon và CS, 1987

Trung Quốc

Cám lúa mì, trấu, bột chanh, bánh đậu tươngloại dầu hoặc bánh hạt bông loại dầu, cám lúa mì hoặt bột ngô

Husey và Tínley, 1981; Ưangta0, 1988

Nigiêria

Bột sắn lên men, ngô, đậu đũa

Ejiofa và Okager, 1989

Brazin

Phụ phẩm của công nghiệp giấy và gỗ thêm tinh bột tan

Moscardi, 1988

Ấn Độ

Bột chanh hoặc bột đậu tương thêm tinh bột tan hoặc rỉ đường

Mumgatti va Raghunathan, 1990

            Ở Việt Nam sản xuất Bt đã được thực hiện tại một số cơ sở như Viện Công nghiệp thực phẩm, Công ty Vi sinh tp Hồ chí Minh…  từ những năm 1989-1996 theo phương pháp lên men chìm, phần lớn các chủng sản xuất là từ nước ngoài (Phạm Thị Thùy, 2004).

            Trong quá trình sản xuất, ngoài việc chọn các chúng có độc tính cao, khả năng tạo sinh khối lớn, các yếu tố sau đây cần có sự quan tâm thích đáng:

-          Chế độ thông gió: 0,5-0,6 m3 môi trường/1 m3 không khí

-          Nhiệt độ: 29-300C

-          Tránh thóa hóa giống: Sau khi lên men 10-15 lần cần thay chủng Bt mới đảm bảo chất lượng

-          Chú ý tránh nhiễm thực khuẩn thể

-          Đánh giá kết quả thông qua:

            + Mật độ bào tử, số lượng tinh thể độc  endotoxin biểu thị bằng đơn vị quốc tế (IU) theo tiêu chuẩn E-61 của Viện Pastuer (Pháp), đạt 16000 IU hoặc 32000 IU, hoặc Tiêu chuân Việt Nam 3-10 tỷ bào tử/1 gam chế phẩm;

            + Chất khô 7-10%

            + pH 7-7,5

            + Hiệu lực diệt sâu 70-90% sau 7 ngày

            + Bảo quản được trong 12 tháng

            Đối với dạng lỏng: khi kết thúc quá trình lên men, đem hỗn hợp với các chất phụ gia, chất bám dính, chất chống thối để tạo chế phẩm. Chế phẩm sau khi tách có độ ẩm 85% và hiệu suất 100 kg/m3 dịch nuôi cấy với lượng bào tử 20.109/g.

            Đối với dạng khô: sản phẩm được tách nhờ máy ly tâm, làm khô bằng đông lạnh hoặc xây khô trong máy sấy phun hoặc lý tâm vắt sau đó trộn với các phụ gia như bột, lactoza, thạch tín, cao lanh… Khi đóng gói, hàm lượng chất khô tiêu chuẩn đạt 7-10%.