7.1 Đại cương về protein

Protein được tạo nên từ các gốc aminoacid. Các gốc này nối với nhau bằng liên kết peptide. Liên kết peptide là liên kết giữa nhóm carboxyl của 1 aminoacid và nhóm amin của một aminoacid tiếp theo, và thực ra ở đây 1 H của nhóm NH2 được thay thế bởi acyl của aminoacid. Trong 1 dipeptide có hai, trong 1 tripeptide có ba và trong 1 oligopeptide có từ 3 cho đến 10 gốc aminoacid liên kết với nhau bằng liên kết peptide. Polypeptide chứa nhiều gốc aminoacid.

Những hợp chất gồm nhiều gốc aminoacid nối với nhau bằng liên kết peptide được gọi là polypeptide. Mỗi aminoacid chứa 3 nhóm nguyên tử (NH, CH và CO) cấu tạo nên theo sơ đồ nghiêm ngặt sau:

Ba nhóm nguyên tử này là luôn lặp lại trong chuỗi polypeptide, phần còn lại của các gốc aminoacid (R) là chuỗi bên.

Trong các protein tự nhiên có mặt 20 loại aminoacid khác nhau. Nếu một chuỗi ngắn có 4 gốc aminacid (tetrapeptide) thì từ đó đã có 204 = 160 000 khả năng, nghĩa là có 160 000 tetrapeptide khác nhau. Nếu độ dài 1 chuỗi gồm 300 gốc aminoacid, một độ dài mà thường gặp đối với nhiều polypeptide, thì người ta có một số lượng không tưởng tượng được là 10300 khả năng. Nhưng trong tự nhiên chỉ tồn tại một số lượng nhỏ các khả năng trên.

Như trên đã nêu, tất cả polypeptide có cùng một trình tự CO-CH-NH. Đặc tính của từng polypeptide và của protein được xác định do đặc tính hoá học của các gốc aminoacid, nó có thể tích điện âm, dương, ưa nước hay kỵ nước. Trong tự nhiên, tuỳ thuộc vào trình tự và thành phần, đã tạo nên rất nhiều ái lực hoá học khác nhau, chúng có ý nghĩa lớn trong các phản ứng hoá học và đối với sự nhận biết trình tự aminoacid. Trong đó có những vùng gốc aminoacid chủ yếu là acid hoặc base, những vùng khác là những gốc aminoacid ưa nước hay kỵ nước. Những protein của màng thường có những gốc kỵ nước, những gốc hướng ra ngoài hoặc nhô vào tế bào chất là ưa nước. Sơ đồ ở hình 7.1 là một ví dụ.

7.2 Chức năng của protein

Chức năng của protein được chia ra các nhóm như sau:

1. Chức năng enzyme

2. Chức năng cấu trúc

3. Chức năng dự trữ

4. Chức năng vận chuyển

5. Hormone

6. Chức năng bảo vệ

7. Chức năng co rút

8. Chất độc

Về chức năng enzyme của protein đã được đề cập nhiều lần, đặc biệt trong "cấu tạo và cơ chế tác động của enzyme". Protein là chất xây dựng đóng một vai trò đặc biệt quan trọng trong cơ thể động vật. Chất khung được tạo nên từ protein. Thuộc loại này gồm có da, tóc, sừng, lông và collagen là thành phần cơ bản của gân và có khoảng 18% tham gia vào cấu tạo của xương.

Một chức năng phổ biến khác của protein là cấu tạo nên màng sinh học.

Màng sinh học có chức năng là giới hạn những vùng trao đổi chất và tham gia vào việc vận chuyển các chất. Màng sinh học cũng có khả năng chuyển đi những tín hiệu. Protein màng cũng có thể là các enzyme. Chức năng này được thể hiện ở màng trong của ty thể và lạp thể. Màng sinh học bao gồm lớp kép lipid với những protein phân bố ở trong đó. Những thành phần lipid quan trọng nhất là phosphoglyceric, glycoglyceric, sterol và sphingolipid. Lớp kép lipid của màng sinh học là những phân tử lipid có những đuôi kỵ nước quay lại với nhau, trong khi đó những gốc đường và phosphate hướng ra phía ngoài (hình 7.2).

Ở đây thành phần glycerine là trục vuông góc với mặt phẳng của màng. Lớp kép lipid không đối xứng, nghĩa là ở hai phía của màng có những phân tử lipid khác nhau. Những phân tử protein nằm trong lớp kép lipid làm bền vững màng và nhô ra ở hai phía màng (hình 7.2). Thành phần protein nằm ở trong lớp kép lipid, có đặc tính chủ yếu là kỵ nước, thành phần protein mà nhô ra phía ngoài, có đặc tính chủ yếu là ưa nước. Sợi protein nhô ra ở phía tế bào chất thường kết hợp với một protein ngoại vi, những phân tử protein hướng về phía màng tế bào thì thường kết hợp với một chuỗi carbohydrate (hình 7.2).

Ở trong lớp kép lipid thì phân tử protein có những liên kết kỵ nước và liên kết ion. Những liên kết ion như liên kết giữa nhóm NH3+ của protein và của gốc phosphate của phospholipid. Những liên kết này nhạy cảm với độ pH. Vì vậy màng sinh học bị ảnh hưởng, thậm chí bị phá huỷ bởi giá trị pH thái quá. Mức độ quánh đặc nhiều hay ít của màng sinh học bị ảnh hưởng lớn bởi nhiệt độ. Ở nhiệt độ thấp màng sinh học có cấu trúc giống như tinh thể. Khi nhiệt độ tăng lên đến nhiệt độ chuyển pha cấu trúc rắn sẽ chuyển sang cấu trúc tinh thể lỏng. Nhiệt độ chuyển pha tăng theo độ dài và độ no của acid béo. Ca2+ làm ổn định màng, nó liên kết với những nhóm ở phần đầu chủ yếu tích điện âm, ví dụ gốc phosphate của phospholipid. Ca2+ có khả năng tạo liên kết với hai nhóm tích điện âm. Vì vậy Ca2+ sẽ làm giảm tính thấm của màng, trong khi những ion hoá trị một, đặc biệt là H+ làm tăng tính thấm. Tính thấm cũng bị ảnh hưởng bởi đặc tính của lipid. Thành phần steroid và những gốc acid béo no và có mạch carbon dài làm cho màng sít lại, những gốc acid béo chưa no làm cho màng lỏng lẻo ra, do vậy làm tăng tính thấm của màng.

Khi người ta nói đến tính thấm của màng chủ yếu là nói đến tính thấm của những chất ưa nước. Những chất này thấm qua màng rất ít, trong khi đó những phân tử kỵ nước có thể thấm qua hoặc khuếch tán qua màng. Hầu hết những chất trao đổi có đặc tính ưa nước, đối với chúng màng sinh học là cái chắn đáng kể và ở đây chúng cần một cơ chế đặc biệt hơn để vận chuyển qua màng.

Protein dự trữ được tích luỹ trong mô dự trữ và khi cần sử dụng thì được huy động. Protein dự trữ điển hình ở động vật là protein trứng và sữa. Đó là protein cần thiết đối với động vật còn non, tương tự protein của hạt và quả, là nguồn dinh dưỡng đối với cây con.

Chất lượng protein được đánh giá theo thành phần các aminoacid không thay thế. Đó là những aminoacid mà cơ thể người và động vật không có khả năng tổng hợp được. Hàm lượng các aminoacid không thay thế của các loại protein khác nhau được trình bày ở bảng 7.1 và 7.2

Những protein động vật, và cả protein của lá cây phần lớn là giàu aminoacid không thay thế. Protein của hạt và ngũ cốc chứa ít aminoacid không thay thế. Ở protein ngũ cốc là lysine, ở protein hạt và đậu các loại là methionine có hàm lượng thấp và nó giới hạn giá trị sinh học của những loại protein này.

Ở sự giải độc các kim loại nặng nhờ những polypeptide đơn giản theo kiểu phytochelatin có ý nghĩa quan trọng. Ví dụ polypeptide đơn giản có nguồn gốc từ glutation và có công thức chung như sau:

(g-glutamyl-cysteinyl)n-glycine

Do có nhiều nhóm SH chúng có khả năng kết hợp chặt với các kim loại nặng, làm cho những kim loại nặng này không thể gây rối loạn trao đổi chất. Sự tổng hợp phytochelatin được kích thích bởi những kim loại nặng như Cd, Cu, Ag, Bi và Au.

Protein bảo vệ có một vai trò lớn trong sinh học miễn dịch. Động vật có xương sống có một cơ chế phức tạp, phát triển cao, với cơ chế này chúng ngăn ngừa những tác nhân vi sinh vật gây bệnh (virus, vi khuẩn, nấm, chất độc vi khuẩn). Chức năng này có phần liên quan đến đặc tính của chuỗi polypeptide. Hệ thống tự vệ toàn bộ, sinh học miễn dịch là một lĩnh vực khoa học phát triển độc lập. Một protein lạ (virus, vi khuẩn, nấm) xâm nhập vào máu hoặc vào mô thì cơ chế tự vệ được huy động rất nhanh. Protein lạ được gọi là antigen. Nó có một vùng gồm một trật tự xác định các nguyên tử, với vùng này nó kết hợp với tế bào lympho và kích thích tế bào này sản sinh ra kháng thể. Những tế bào lympho tồn tại trong hệ thống miễn dịch với số lượng 109 và có trên bề mặt của nó những vùng nhận, nơi mà antigen được kết hợp vào. Những vùng nhận này rất khác nhau và "phù hợp" mỗi vùng cho 1 antigen xác định. Những tác nhân khác nhau có những tế bào lympho xác định khác nhau với những vùng nhận phù hợp. Khi một antigen kết hợp với tế bào lympho thì nó bắt đầu sản sinh kháng thể đặc hiệu đối với tác nhân gây bệnh. Những tế bào lympho khác không được kích thích cho việc sản sinh ra kháng thể. Có sẵn một số lượng lớn các tế bào lympho khác nhau, chúng có thể tổng hợp được rất nhanh những kháng thể khác nhau khi kháng nguyên xuất hiện. Những loại kháng thể khác nhau này là xác định, tồn tại với số lượng không đếm được, có thể một vài triệu, ở đây mỗi một loại có một vị trí kết hợp duy nhất đặc trưng. Khả năng lớn không thể tưởng tượng được của hệ thống miễn dịch đã làm cho protein lạ, protein của tác nhân gây bệnh trở thành vô hại. Những kháng thể này được gọi là globulin miễn dịch. Chúng chiếm khoảng 20% protein tổng số trong máu.

Globulin miễn dịch Ig được chia làm 5 nhóm khác nhau. Tuy nhiên thành viên cơ bản Ig các nhóm đều có dạng chữ Y. Cấu trúc này gồm 2 sợi polypeptide ngắn, xác định, mỗi sợi có khoảng 220 gốc aminoacid (hình 7.4).

Hình 7.4: Sơ đồ biểu diễn kháng thể và kháng nguyên.

a) Kháng thể gồm 4 chuỗi polypeptide

b) Kháng thể kết hợp với kháng nguyên

c) Kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

Cơ chế mà kháng thể nhận biết vị trí kháng nguyên của protein lạ là đặc biệt thú vị. Sự kết hợp giữa kháng thể và kháng nguyên là thuận nghịch và có thể so sánh với sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất.

Liên kết này không phải đồng hoá trị mà là những liên kết hydro và liên kết ion. Điều đó làm rõ rằng trình tự aminoacid của vị trí kết hợp xác định tính đặc hiệu của liên kết. Từ đó rút ra rằng chuỗi polypeptide ngắn hay dài của kháng thể là một đoạn siêu biến có từ 20-30 gốc aminoacid, người ta cho rằng, trong vùng siêu biến này chứa vị trí liên kết đặc hiệu đối với kháng thể. Chỗ kết hợp thực sự chỉ gồm 5-10 aminoacid. Vị trí kết hợp rất chọn lọc đối với kháng nguyên.

Ví dụ protein vận chuyển là albumin và hemoglobin trong máu, myoglobin trong mô cơ và leghemoglobin ở trong màng của Rhizobium. Albumin vận chuyển acid béo. Hemoglobin, myoglobin, leghemoglobin có khả năng kết hợp lỏng lẽo với O2 ở heme của chúng. Chúng giống nhau ở chỗ đều là phương tiện vận chuyển O2. Sự kết hợp này chỉ xảy ra ở dạng Fe khử (Fe2+), nghĩa là kết hợp với heme. Hemoglobin vận chuyển O2 từ phổi qua máu đến những cơ quan và mô rất khác nhau. Leghemoglobin điều khiển sự cung cấp O2 cho chuỗi enzyme hô hấp của vi khuẩn. Myoglobin vận chuyển O2 trong mô cơ, có nhiều trong mô cơ của người lặn và là chất dự trữ O2. Trong khi lặn (khi dừng thở) thì O2 được kết hợp với myoglobin, được giải phóng ra ở ty thể. Fe2+ của heme có thể kết hợp với CN- và CO làm cho vị trí hấp thụ O2 bị đóng lại, hậu quả là O2 không được vận chuyển, dẫn đến chết ngạt. Nồng độ tương đối cao CO trong không khí cũng như sự đốt cháy không hoàn toàn trong động cơ, và khi hút thuốc lá, cản trở sự vận chuyển O2 trong máu. Người ta gọi là "hút bị động", là nguyên nhân gây hại đến sức khoẻ

Ví dụ về chức năng hormone của protein là insulin, gồm 1 chuỗi A với 21 aminoacid và 1 chuỗi B với 30 aminoacid, hai chuỗi này được nối với nhau qua hai cầu disulfide. Insulin điều khiển nồng độ đường glucose trong máu. Khi không đủ insulin thì sự tiếp nhận đường trong tế bào bị hạn chế. Vì vậy mức đường trong máu tăng và dẫn đến sự thải đường mạnh mẽ qua nước tiểu (bệnh đái đường). Vì vậy những tế bào này thiếu đường làm cho toàn bộ cơ thể suy yếu.

Một số peptide quan trọng trong tự nhiên:

- Glutation (tripeptide): glutamyl-cysteinyl-alanine: là một tripeptide có chức năng sinh lý quan trọng. Nó được tạo nên từ 1 gốc glutamyl, 1 gốc cysteine và glycine.

Hai nguyên tử glutatione có khả năng phản ứng để tách 2H tạo thành 1 disulfide. Đây là hệ thống đệm sulfhydryl, chức năng quan trọng nhất của nó là giữ nhóm SH của enzyme và coenzyme ở trạng thái khử. Glutathione có trong tất cả các cơ thể sống, tham gia vào nhiều phản ứng oxy hoá khử, ví dụ sự giải độc các gốc độc. Ngoài ra trong thực vật glutathione còn là dạng dự trữ và dạng vận chuyển lưu huỳnh ở dạng khử. Trong những loài cỏ có những tripeptide tương tự như glutatione và trong cây họ đậu 1 glutamyl-cysteinyl-alanine được tìm thấy.

Những dạng tương tự có chức năng như glutatione. Cysteine và cystine về nguyên tắc tạo nên hệ thống oxy hoá khử tương tự glutatione, biểu diễn như sau:

Oxytocin và vasopressin: Oxytocin và vasopressin là những oligopeptide, chúng có cấu trúc rất giống nhau, đều bao gồm 9 gốc aminoacid khác nhau, trong phân tử có một cầu disulfide. Hormone oxytocin kích thích phần cơ phẳng của ruột già, bàng quang, túi mật và tử cung. Hormone vasopressin ảnh hưởng đến co rút của phần cơ phẳng của mạch máu, làm tăng áp huyết. Vasopressin có vai trò quan trọng trong việc làm đặc nước tiểu. Nếu nồng độ thấp thì động vật có vú thải ra 1 lượng lớn nước tiểu loãng, là một bệnh được gọi là bệnh tháo nhạt.

7.3 Các bậc cấu trúc của protein

Phần lớn các liên kết có trong chuỗi polypeptide có thể quay tự do và trục của 1 chuỗi polypeptide rất linh động. Tuỳ thuộc vào lực tác động mà chúng có những dạng rất khác nhau. Sự biến dạng của một chuỗi peptide, sự sắp xếp của những phần sợi, sự uốn cong và những nếp gấp có trong một chuỗi peptide, được gọi là cấu trúc.

Để thuận tiện người ta thường phân biệt cấu trúc của phân tử protein thành 4 bậc như sau: bậc I, bậc II, bậc III và bậc IV.

Cấu trúc bậc I là trình tự sắp xếp các gốc aminocid trong chuỗi polypeptide. Cấu trúc này được giữ vững nhờ liên kết peptide (liên kết cộng hoá trị).

Vì mỗi một aminocid có gốc khác nhau, các gốc này có những đặc tính hoá học khác nhau, nên một chuỗi polypeptide ở các điều kiện khác nhau có những đặc tính hoá học rất khác nhau.

Tuy nhiên về tổng quát thì tất cả các sợi polypeptide được xây dựng một cách có hệ thống từ các nhóm nguyên tử CO, CH và NH. Sự xây dựng có hệ thống này là cơ sở để tạo nên cấu trúc bậc hai.

Cấu trúc bậc II là tương tác không gian giữa các gốc aminoacid ở gần nhau trong mạch polypeptide. Cấu trúc được làm bền chủ yếu nhờ liên kết hydro được tạo thành giữa các liên kết peptide ở kề gần nhau, cách nhau những khoảng xác định.

Cấu trúc bậc hai của phân tử protein: xoắn a (a-helix), phiến lá gấp b và xoắn collagen. Loại a-helix là sợi ở dạng xoắn ốc, quấn xung quanh một trục, mỗi vòng xoắn có 3,6 gốc aminoacid (hình 7.5).

Ở đây do nhóm CO và nhóm NH của aminoacid thứ tư trên chuỗi gần nhau, giữa hai nhóm này có thể tạo nên một cầu hydro. Các liên kết H tương đối lỏng lẽo và có thể được cắt đứt khi nhiệt độ cao. Phân tử protein mất cấu trúc bậc hai thì enzyme mất hoạt tính xúc tác.

a-helix là cấu trúc của hầu hết những protein mạch thẳng (protein sợi). Dạng sợi tồn tại ở trong a-keratin của tóc, lông, móng và da từ chuỗi polypeptide có cấu trúc a. Cấu trúc này trong phân tích Rơnghen là những chu kỳ 0,5-0,55 nm. Khi xử lý bằng hơi nước người ta có thể kéo dài chuỗi, lúc này xuất hiện chu kỳ là 0,7 nm.

Cấu trúc tồn tại ở trong b-keratin được gọi là cấu trúc phiến lá gấp. Như trong hình 7.6 chúng gồm những sợi polypeptide đối song, gắn với nhau bằng các liên kết hydro. Khác với a-helix, những liên kết hydro được tạo nên không phải trong một sợi mà giữa sợi này với một sợi khác. Như vậy có thể nhiều sợi kết hợp với nhau để tạo "phiến lá gấp". Cấu trúc phiến lá gấp tồn tại trong sợi lụa, nhưng cũng có trong những vùng của protein hình cầu.

Thuộc protein thẳng còn có collagen, gồm 3 sợi polypeptide xoắn vào nhau, chúng lại kết hợp nhiều sợi lại với nhau bằng liên kết đồng hoá trị (hình 7.7). Đại phân tử này chỉ có một số cầu hydro được tạo nên, vì ngoài glycine nó được tạo nên chủ yếu từ proline và hydroproline. Khi một aminoacid đi vào để tạo liên kết peptide, trong chuỗi peptide còn lại 1 N là yếu tố cấu tạo chứ không phải là -NH-, như được chỉ ra trong sơ đồ dưới . Ở đây 1 H của nhóm NH được thay thế bằng 1 aminoacyl, nghĩa là thiếu H cho việc tạo liên kết hydro và vì lý do này mà sợi peptide không thể tự xoắn được.

Những sợi collagen chạy song song tạo nên những bó sợi dai của gân. Collagen cũng có trong xương và trong các mô nối. Elastin là một protein, gồm những sợi protein tương đối ngắn, gắn kết với nhau nhờ liên kết đồng hoá trị (hình 7.7). Những sợi polypeptide quay theo dạng xoắn ốc, tự duỗi xoắn khi có áp lực (hinh 7.8). Vật liệu này tạo nên một khối dạng keo dính, cho phép quay trong không gian ngoài tế bào và sự co rút của các mô.

Những ví dụ này nói lên rằng polypeptide có nhiều đặc tính và chức năng khác nhau.

Việc xác định cấu trúc bậc I của phân tử protein có ý nghĩa quan trọng:

- Là bước đầu tiên quan trọng để xác định cơ sở phân tử hoạt tính sinh học, tính chất hoá, lý của protein.

- Là cơ sở xác định cấu trúc không gian của phân tử protein dựa vào cấu trúc không gian của các phân tử protein tương đồng.

- Cấu trúc bậc I là bản phiên dịch mã di truyền. Vì vậy cấu trúc này nói lên quan hệ họ hàng và lịch sử tiên hoá của thế giới sinh vật.

- Là yếu tố góp phần quan trọng trong nghiên cứu bệnh lý phân tử. Kết quả nghiên cứu cho thấy: khi thay đổi thứ tự aminoacid, thậm chí chỉ một gốc aminocid trong phân tử protein có thể làm thay đổi hoạt tính sinh học, gây những bệnh đặc trưng. Ví dụ điển hình là bệnh thiếu máu hồng cầu hình lưỡi liềm, là do cấu trúc bậc I của hemoglobin thay đổi: gốc aminocid ở vị trí thứ 6 trong chuỗi b của hemoglobin A (bình thường) bị thay thế bằng gốc aminoacid valin.

- Là cơ sở để tổng hợp nhân tạo protein bằng phương pháp hoá học hoặc bằng phương pháp công nghệ sinh học. Frederick Sanger (1953) đã đề ra phương pháp và sử dụng phương pháp này thành công để xác định trình tự sắp xếp các aminocid trong phân tử insulin (polypeptide có hoạt tính hormone). Đến nay rất nhiều protein đã được xác định cấu trúc bậc I. Insulin là protein đầu tiên được tổng hợp bằng phương pháp hoá học vào năm 1966. Ngày nay bằng phương pháp công nghệ sinh học người ta sử dụng E.coli để tổng hợp insulin.

Cấu trúc bậc III là tương tác không gian giữa các gốc aminacid ở xa nhau trong chuỗi polypeptide, là dạng cuộn lại trong không gian của toàn mạch polypeptide.

Nhiều sợi polypeptide trong cơ thể sống tồn tại không phải ở dạng thẳng mà gập khúc và qua đó mà tạo nên cấu trúc không gian ba chiều. Tuy nhiên cấu trúc này hoàn toàn xác định, chủ yếu là do trình tự các aminoacid và môi trường. Khi một sợi polypeptide tách ra khỏi ribosome sau khi tổng hợp và được thải ra trong tế bào chất như là môi trường tạo hình thì nó hình thành nên cấu trúc tự nhiên rất nhanh, đặc biệt đối với cấu trúc hình cầu, mang lại cho protein những đặc tính sinh lý quan trọng. Có thể do chuyển động nhiệt của các sợi polypeptide mà các nhóm của các gốc aminoacid tiếp xúc với nhau, dẫn đến có thể kết hợp với nhau. Trong nhiều protein hình cầu có chứa các gốc cysteine, sự tạo thành các liên kết disulfide giữa các gốc cysteine ở xa nhau trong chuỗi polypeptide, làm cho mạch bị cuộn lại đáng kể. Các liên kết khác, như liên kết Val de Waal, liên kết tĩnh điện, phân cực, kỵ nước và hydro giữa các mạch bên của các gốc aminoacid đều tham gia làm bền cấu trúc bậc III, như protein hình cầu biểu diễn ở hình 7.9.

Cấu trúc hình cầu của protein được gọi là cấu trúc bậc ba, là cấu trúc của enzyme. Ở chúng một nhóm prosthetic có thể kết hợp đồng hoá trị, ví dụ heme. Nhưng những nhóm gốc aminoacid riêng lẽ cũng có thể là các nhóm hoạt động trong phản ứng enzyme. Sự hoà tan của protein được xác định ở một mức độ nhất định nhờ cấu trúc bậc ba. Ở nhiều protein hình cầu các nhóm kỵ nước định hướng vào bên trong, những nhóm ưa nước hướng ra ngoài. Những nhóm ưa nước này kết hợp với nước như là chất hoà tan bằng các cầu hydro, phức hệ này tồn tại trong dung dịch. Trình tự aminoacid của protein của những enzyme cùng chức năng cho biết mức độ quan hệ họ hàng của các loài. Mức độ quan hệ họ hàng càng gần, thì mức độ tương ứng về trình tự aminacid càng lớn. Điều rất thú vị ở đây là những đoạn trình tự quan trọng nhất, ví dụ những vùng phản ứng, trong quá trình tiến hoá hầu như không thay đổi, được bảo tồn và như vậy cấu trúc bậc hai, bậc ba được duy trì.

Cấu trúc bậc IV: Cấu trúc này được hình thành ở các phân tử protein gồm 2 hay nhiều chuỗi polypeptide hình cầu. Tương tác không gian giữa các chuỗi này trong phân tử gọi là cấu trúc bậc IV. Mỗi chuỗi polypeptide này gọi là " phần dưới đơn vị" (subunit). Sự kết hợp giữa các phân tử này lỏng lẽo và chủ yếu là do liên kết hydro và kỵ nước. Bằng cách này hai phân tử xác định có thể kết hợp với nhau tạo thành 1 dimer. Một thí dụ về sự kết hợp này là hemoglobin, được tạo nên từ 2 chuỗi a với mỗi chuỗi có 141 và 2 chuỗi b với mỗi chuỗi là 146 gốc aminoacid. Đại phân tử dạng này bên cạnh protein còn là thành phần cấu tạo của nucleic acid, các ribosome. Các ribosome của sinh vật tiền nhân gồm 55 sợi polypeptide khác nhau và 3 nucleic acid khác nhau kết hợp lại. Nhiều virus có lớp vỏ bên ngoài, có cấu tạo từ nhiều phân tử protein xác định và bao quanh nucleic acid xoắn ốc ở bên trong. Các đại phân tử trên kết hợp với nhau tự động trong môi trường phù hợp để thành dạng tồn tại trong tự nhiên.

Đặc tính vật lý của protein phụ thuộc vào đặc tính hoá học của các gốc aminoacid ở protein hình cầu cũng như ở sự gập khúc của chúng. Chiếm ưu thế trong sự kết hợp của các aminoacid có tính acid thì protein có tính acid. Chủ yếu là aminoacid có tính kiềm là protein kiềm. Những sợi protein có nhiều nhóm ưa nước là do những aminoacid phân cực và hydroxyacid thì có độ hoà tan lớn. Ngược lại, thành phần của gốc kỵ nước (valine, leucine, isoleucine) thì độ hoà tan của những protein này thấp.

Trọng lượng phân tử protein phụ thuộc vào độ dài của từng chuỗi polypeptide và số lượng các sợi polypeptide cấu tạo nên 1 phân tử protein. Về khía cạnh này bảng 7.3 chỉ ra sự khác nhau đáng kể giữa các phân tử protein riêng lẽ.

Bảng 7.3 Trọng lượng phân tử và số lượng sợi polypeptide của một số phân tử protein

Cấu trúc của một hoặc nhiều chuỗi polypeptide có ý nghĩa quan trọng đối với độ hoà tan và chức năng của chúng. Cấu trúc protein được hiểu là sự sắp xếp của những sợi riêng lẽ hoặc nhiều sợi. Chúng phụ thuộc nhiều vào độ pH của môi trường. Protein và chuỗi polypeptide hoà tan tốt khi những nhóm ưa nước hướng ra phía ngoài, nhóm kỵ nước hướng vào bên trong. Khi một protein thay đổi cấu trúc thì những nhóm kỵ nước quay ra ngoài, protein mất khả năng hoà tan trong nước, ví dụ trường hợp kết tủa không ở dạng tinh thể của protein sữa trong môi trường chua. Acid lactic được sản sinh do vi khuẩn làm giảm pH sữa, làm thay đổi protein sữa. Nhiều nhóm kỵ nước được hướng ra bên ngoài, protein mất khả năng tan trong nước. Vì vâỵ sự thường xuyên duy trì giá trị pH trong tế bào chất rất quan trọng, vì chỉ có như vậy chức năng hoạt động của các enzyme trong tế bào chất mới được đảm bảo.

Bên cạnh H+ còn có những cation khác có ý nghĩa đối với các phản ứng enzyme ví dụ K+. Nồng độ của nó trong tế bào chất cao hơn so với các loại cation khác và nằm trong khoảng 100 đến 150 mM. Nồng độ K+ cao có ý nghĩa đối với sự tổng hợp protein.

Nồng độ Ca2+ trong tế bào chất rất thấp, tuy nhiên nó có vai trò quan trọng đối với cấu trúc của các protein khác nhau. Calmodulin là một polypeptide kết hợp với Ca2+ làm cho các vùng kỵ nước được hướng ra ngoài, các vùng này kết hợp với các enzyme và hoạt hoá các enzyme như phosphodiesterase, adenylate-cyclase, photoarylase và ATPase. Bằng cách tương tự troponin C và paralbumin hoạt hoá những enzyme khác bằng việc thay đổi cấu trúc khi kết hợp với Ca2+. Những Ca-protein này thay đổi phản ứng enzyme. Những liên kết thực hiện ở những vị trí hoàn toàn xác định, thực chất là helix-dãi nối-helix (hình 7.10).

Dạng này của một liên kết Ca tồn tại từng đôi và đặc trưng đối với calmodulin, troponin C và paralbumin. Cấu trúc này bao gồm một chuỗi polypeptide có 12 gốc aminoacid, trong đó 7 nhóm carboxyl có nguyên tử O kết hợp với Ca2+. Cấu trúc này tương ứng với một hình tháp đôi 5 mặt, nghĩa là một diện tích cơ bản với 5 mặt, ở phía trên và phía dưới còn có một CO. Ở trung tâm cấu trúc không gian ba chiều này có nguyên tử Ca2+, ở mỗi một gốc có 1 nhóm CO (hình 7.11).

Liên kết với Ca2+ ở trung tâm làm thay đổi cấu trúc của protein.

Troponin C có tổng số 4 vị trí kết hợp với Ca2+, trong đó 2 liên kết có ái lực mạnh và 2 liên kết có ái lực yếu. Sự bão hoà Ca2+ phụ thuộc vào nồng độ Ca2+ trong hệ thống. Cũng như vậy đối với calmodulin. Nồng độ Ca2+ cũng ảnh hưởng đến những quá trình enzyme bằng những Ca-protein. Vai trò quan trọng nhất của troponin C là điều khiển sự co rút của mô cơ. Paralbumin cũng có mặt trong mô cơ, có ý nghĩa đối với thư giản mô cơ. Vị trí kết hợp của nó với Ca2+ cũng có ái lực cao với Mg2+.

7.4 Aminoacid

Phần lớn nhất của những chất nitơ hữu cơ dễ hoà tan trong thực vật là aminoacid, amide và amine. Trong trao đổi chất thì aminocid có vai trò rất quan trọng. Chúng là vật liệu tạo nên protein. Công thức chung của aminoacid:

Nhóm amine đính ở nguyên tử C2, theo tên cũ là nguyên tử Ca. Vì vậy người ta gọi là nhóm a-amine. Các aminoacid tồn tại chủ yếu trong tự nhiên có nhóm amine đứng ở bên trái trục, được gọi là aminoacid dạng L. Dạng D-aminoacid tồn tại chỉ riêng biệt, ví dụ trong thành tế bào vi khuẩn.

Mỗi một aminoacid ít nhất được đặc trưng bởi 1 nhóm carboxyl và 1 nhóm amine. Hơn 100 loại aminoacid khác nhau mà người ta đã biết, có khoảng 20 loại là thành phần của protein. Dưới đây là những aminoacid quan trọng và công thức hoá học của chúng. Để đơn giản và theo thói quen nhóm carboxyl của aminoacid proton hoá. Tuy nhiên ở dạng này không có aminoacid nào tồn tại, vì như đã nêu trên, khi nhóm carboxyl phân ly, thì nhóm NH2 phải phân ly. Proton hoá hay khử proton hoá luôn luôn phụ thuộc vào pH của môi trường.

Các aminoacid riêng biệt có những đặc tính khác nhau là do phần gốc aminoacid. Ở những aminoacid trung tính có tính trung tính. Khi chiều dài chuỗi tăng thì có đặc tính kỵ nước. Protein có chứa nhiều aminoacid như valine, leucine, isoleucine có đặc tính kỵ nước là chủ yếu. Những aminoacid có tính acid trong phần gốc có 1 nhóm carboxyl. Protein chứa nhiều aminoacid có tính acid là những protein acid. Tương tự như vậy đối với protein, chủ yếu được tạo nên từ những aminoacid có tính kiềm là những protein kiềm. Phần gốc của aminoacid có ý nghĩa quyết định đối với đặc tính của protein mà chúng tạo nên. Điều này không những có ý nghĩa đối với tính chất hoá học mà cả cấu trúc của protein.

7.4.1 Phân loại aminoacid

Thủy phân hoàn toàn protein, thu được chủ yếu các L-a-aminoacid. Mặc dù protein rất đa dạng nhưng hầu hết chúng đều được cấu tạo từ 20 L-a-aminoacid. Dựa vào đặc tính của mạch bên (gốc R) aminoacid được chia làm 7 nhóm chính sau đây:

1. Aminoacid trung tính mạch thẳng

Nhóm này gồm 5 aminoacid: glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine. Các aminoacid này đều có 1 nhóm amine và 1 nhóm carboxyl.

Glycine là axit amine đơn giản nhất, nhóm R của nó là nguyên tử H, là aminoacid duy nhất không chứa carbon bất đối. Bốn aminoacid còn lại có mạch bên không phân cực.

2. Các hydroxyl aminoacid mạch thẳng

Thuộc nhóm này có 2 aminoacid là serine và threonine. Chúng giống với nhóm trên ở chỗ chỉ có 1 nhóm amine, 1 nhóm carboxyl và cũng là mạch thẳng nhưng có chứa 1 nhóm OH.

3. Aminoacid chứa lưu huỳnh mạch thẳng

Nhóm này có 2 aminoacid là cysteine và methionine. Khi oxy hoá 2 nhóm -SH của 2 phân tử cysteine tạo thành cystine có chứa cầu (-S-S-).

4. Các aminoacid acid và các amide

Thuộc nhóm này có aspartic acid và glutamic acid . Trong phân tử của chúng có 1 nhóm amine và 2 nhóm carboxyl. Ở pH sinh lý (6-7) các aminoacid này tích điện âm.

Amine hoá nhóm carboxyl ở mạch bên của aspartate và glutamate tạo thành các amide tương ứng là asparagine và glutamine.

Ở sự tổng hợp glutamic acid một nhóm amine từ 1 chất cho được chuyển đến cetoacid. Người ta gọi quá trình này là chuyển amine hoá do enzyme transaminase xúc tác. Enzyme này có nhóm prosthetic là pyridoxalphosphate.

5. Các aminoacid kiềm

Trong nhóm này lysine và arginine tích điện dương (ở pH =7), còn histidine chứa nhóm imidazol có tính base yếu ở pH = 7

6. Iminoacid (proline)

Prolin khác với tất cả các aminoacid khác ở chỗ nhóm amine bậc 1 ở Ca kết hợp với mạch bên tạo thành vòng pyrrolidine. Do đó proline là một iminoacid chứa nhóm amine bậc 2.

7. Các aminoacid thơm và dị vòng

Các aminoacid thuộc nhóm này là phenylalanine, tyrosine và tryptophan. Do có chứa vòng thơm nên các aminoacid này có một số phản ứng đặc trưng.

Những aminoacid thơm là những tiền chất của nhiều alcaloid, phytohormone như indolacetic acid.

Những gốc aminoacid của histidine, lysin và cysteine là những nhóm hoạt hoá enzyme. Những aminoacid thơm tyrosin có họ hàng gần với thyronine, đây là tiền chất của hormone tuyến giáp trạng thyrocine. Thyrocine được tạo nên trong tuyến giáp trạng từ thyronin nhờ sự kết hợp với iod.

7.4.2 Tính chất của aminoacid

Tính chất lưỡng tính của aminoacid

Trong cấu tạo của aminoacid vừa có nhóm amine (-NH2) thể hiện tính base, vừa có nhóm carboxyl (-COOH) thể hiện tính acid, nghĩa là chúng mang tính lưỡng tính và có thể phân ly thành ion H+ và OH-. Trong dung dịch nước, các aminoacid có thể đồng thời phân ly như sau:

Những công trình nghiên cứu về quang phổ khuếch tán đã xác nhận rằng: phân tử aminoacid không có nhóm carboxyl tự do, cũng như không có nhóm amine tự do và chúng đều là muối nội có dạng như sau:

Do có tính lưỡng tính nên aminoacid là những chất đệm tốt. Vì aminoacid có tính lưỡng tính trong dung dịch nước nên tuỳ theo pH của dung dịch mà sự phân ly của nhóm carboxyl hoặc nhóm amine sẽ bị kìm hãm và aminoacid thể hiện tính kiềm hoặc tính acid.

Trong môi trường acid, khi nồng độ H+ cao, sự phân ly của nhóm carboxyl sẽ bị kìm hãm và phân tử aminoacid tích điện dương, trong điện trường nó sẽ dịch chuyển về phía cực âm.

Trong môi trường kiềm, dưới tác dụng của các ion OH- sự phân ly của nhóm amine sẽ bị kìm hãm, nhóm carboxyl sẽ bị phân ly, phân tử aminoacid tích điện tích âm và dịch chuyển về cực dương trong điện trường.

Ở điểm đẳng điện pI (isoelectric point) phân tử aminoacid trung hoà về điện và nó không dịch chuyển trong điện trường.

Tuỳ theo số nhóm carboxyl và nhóm amine trong phân tử aminoacid cũng như tuỳ theo hằng số phân ly của các nhóm này mà điểm đẳng điện pI của các aminoacid sẽ khác nhau.

Các aminoacid monoamine dicarboxylic (aspartic acid, glutamic acid) có điểm đẳng điện trong môi trường acid, các aminoacid diamine monocarboxylic (acginine, histidine, lysine) có điểm đẳng điện trong môi trường kiềm.

Bảng 7.4 Điểm đẳng điện của các aminocid

Tên aminoacid

Điểm đẳng điện (pI)

Tên aminoacid

Điểm đẳng điện (pI)

Alanine

Arginine

Asparagine

6,00

10,76

5,41

Lysine

Methionine

Hydroproline

9,74

5,74

5,83

Ứng dụng tính lưỡng tính của aminoacid

Nhờ có tính lưỡng tính mà aminoacid có vai trò là chất đệm trong tế bào và trong trao đổi khoáng của cơ thể thực vật.

Dựa vào tính chất này để định tính và định lượng các aminoacid trong dung dịch nghiên cứu bằng phương pháp điện di, sắc ký trên giấy, sắc ký cột...

Cũng do tính chất lưỡng tính mà các aminoacid có thể tạo muối nội đồng thời với acid cũng như base:

Ngoài ra phân tử aminoacid còn tạo muối nội với các ion kim loại nặng như Fe2+, Cu2+ , Zn 2+ ,... đặc biệt với Cu 2+. Cấu hình của muối phức này có thể biểu diễn như sau:

Phản ứng tạo ester

Với rượu, aminoacid có thể tạo thành ester

Các ester của aminoacid đều là những chất lỏng dễ bay hơi, có tính kiềm, dễ điều chế bằng phép cất chân không.

Phản ứng của gốc R

Gốc R là nhóm nguyên tử trong phân tử aminoacid vốn liên kết với nguyên tử Ca và không tham gia trong việc hình thành liên kết peptide. Bản chất hoá học của gốc đã cho phép aminoacid thực hiện nhiều phản ứng khác nhau:

- Phản ứng tạo muối với acid, base và kim loại nặng (do nhóm -NH2 và nhóm -COOH có trong gốc R) như đã trình bày ở trên.

- Phản ứng oxy hoá khử (do nhóm -SH và nhóm -S-S-)

Cysteine và cystine đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển e- và H+ của quá trình oxy hoá khử nói riêng và quá trình trao đổi chất nói chung

- Phản ứng tạo amide (do nhóm -COOH)

Phản ứng xảy ra tương tự với glutamic acid.

- Phản ứng khử amine hoá bởi HNO2 (do nhóm -NH2)

Ngoài ra vòng thơm của aminoacid tham gia phản ứng nitro hoá, halogen hoá và một số phản ứng đặc trưng của aminoacid: phản ứng với aldehyd formic, với ninhydrin...

7.5 Sinh tổng hợp aminoacid

Ở vi khuẩn và lục lạp của thực vật con đường quan trọng nhất để tổng hợp glutamate là từ 2-oxoglutarate và glutamine. Phản ứng này được xúc tác bởi enzym glutamat-synthase.

Ở động vật glutamate xuất hiện chủ yếu bằng phản ứng chuyển amine giữa 2-oxoglutarate và aminoacid. Phản ứng này xảy ra chủ yếu ở gan, là cơ quan trung tâm của sự biến đổi aminoacid.

Ở sự chuyển amine hoá glutamate và aspartate là những chất cho nhóm NH2. Một sự vận chuyển amine từ glutamate đến pyruvate được chỉ ra như sau:

Enzyme xúc tác là glutamat-pyruvat-aminotransferase. a-cetoglutaric acid được tạo nên lại trở thành chất nhận NH3. Nhờ sự chuyển amine mà nhiều aminoacid được tạo thành. Những ví dụ quan trọng nhất là:

a-cetoglutaric acid => glutamic acid

oxaloacetic acid => aspartic acid

glyoxylic acid => glycine

pyruvic acid => alanine

hydroxy pyruvic acid => serine

a-ceto hydroxybutyric acid => threonine

Glutaminsemialdehyde => ornithin

Tuy nhiên không phải tất cả các aminoacid có trong tự nhiên được tổng hợp bằng con đường chuyển amine hoá. Còn có những con đường phản ứng quan trọng khác để tổng hợp nên các aminoacid. Người ta biết các con đường phản ứng tương ứng cho 5 họ aminoacid khác nhau (bảng7.5). Ví dụ ở hình 7.12 chỉ ra con đường tổng hợp của họ glutamic acid.

1. Glutamic acid được phosphoryl hoá nhờ ATP ở nhóm d-carboxyl để tạo thành glutamylphosphate

2. Chất này được khử nhờ NADPH để tạo thành aldehydglutamic acid đồng thời tách ra phosphate.

3. Chất này được amine hoá nhờ enzyme transaminase ở vị trí d-carbon, tạo nên ornithine.

4. Chất này được khử amine hoá nhờ 1 enzyme transaminase ở vị trí a-carbon làm xuất hiện a-ceto-d-amino-valeric acid.

5. Qua sự ngưng tụ một vòng 5 cạnh được tạo nên (pyrrolidincarbonic acid)

6. Chất này được khử thành proline nhờ NADPH.

Bảng 7.5 Những aminoacid quan trọng nhất của các họ aminoacid

Họ glutamic

Họ aspartate

Họ pyruvate

Họ serine

Họ aminoacid thơm

Glutamate

Aspartate

Alanine

Serine

Phenylalanine

Ornithine

Lysine

Valine

Glycine

Tyrosine

Arginine

Methionine

Leucine

Cysteine

Tryptophan

Proline

Threonine

Hydroxyproline

Isoleucine

Arginine cũng thuộc vào họ glutamic acid có thể được tổng hợp nên từ ornithine. Hydroxyproline được tổng hợp từ proline nhờ 1 "oxidase có chức năng hỗn hợp". Chất cho H là ascorbic acid (vitamin C). Như sơ đồ dưới đây nhóm OH định vị ở C3 của ascorbic acid có khả năng phân ly 1 H+. Phân tử này có đặc tính acid. Giá trị pK của nó là 4,2. Ascorbic acid tham gia vào phản ứng với proline khi tách ra phân tử O2, trong đó nó cung cấp nguyên tử H cần thiết cho sự tạo H2O tương ứng.

Sự hydroxyl hoá proline xảy ra không phải ở những phân tử proline riêng biệt, mà xảy ra sau khi phân tử proline đã tham gia cấu tạo protein. Ở dạng này hydroxylproline là thành phần quan trọng trong collagen và elastin. Nếu thiếu aminoacid này sẽ dẫn đến sự rối loạn trong các mô liên kết, mô chống đỡ (xương, răng) và gân. Khi thiếu vitamin C thì việc xây dựng các mô này bị tổn thương (bệnh hoại huyết). Sự rối loạn này được giải thích là thiếu chất cho H, ascorbic acid, để tổng hợp hydroxylproline từ proline.

Proline và hydroxylproline là những aminoacid dị vòng. Ở đây nguyên tử N ở dạng NH. Mặc dù vậy người ta không gọi nó là iminoacid, vì nó thể hiện như aminoacid. Thực tế nguyên tử H bị thiếu được thay thế bởi 1 chất khác. Ở iminoacid có nhóm imine, ở đây nguyên tử N kết hợp với C bằng 1 liên kết đôi (HN=C).

Sự tổng hợp các aminoacid thơm đi từ phosphoenolpyruvate và erythrosophosphate. Con đường tổng hợp phức tạp này không nêu lên ở đây. Một sản phẩm trung gian quan trọng của quá trình này là shikimic acid.

Để tổng hợp cysteine, một aminoacid chứa S, cần khử sulfate. Quá trình này chỉ xảy ra ở thực vật và các vi sinh vật khác nhau, tương tự quá trình khử nitrate, không xảy ra ở động vật.

Sản phẩm đầu tiên của sự khử sulfate là aminoacid chứa S, cysteine. Nó cung cấp S cho tổng hợp những aminoacid quan trọng chứa S khác: methionine. Quá trình phản ứng chỉ ra ở hình 7.13.

1. Phosphohomoserine, một hợp chất tương tự như serine, phản ứng với cysteine để tạo thành cystathionine và tách ra phosphate vô cơ

2. Cystathionine được tách ra thành serine và homocysteine bằng phản ứng thuỷ phân

3. Nhờ có chất cho nhóm CH3 nguyên tử H của nhóm SH của homocysteine (chất này giống cysteine) được thay thế bằng 1 nhóm methyl. Methionine được tạo thành.

7.6 Quá trình khử nitrate

Những nguyên tố cơ bản của carbohydrate và lipid là C, H và O. Ngoài ra còn có các nguyên tố S và P, ví dụ trong phospholipid và sulfolipid, nhưng chúng không phải là các nguyên tố cơ bản. Trong protein và nucleic acid, N là nguyên tố không thể thiếu được. Trước khi đề cập kỷ hơn trao đổi chất của chúng, chúng ta cần tìm hiểu các đại phân tử, các chất trao đổi, các chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp được tạo nên từ các chất vô cơ như thế nào. Sơ đồ sau đây đưa ra 4 "con đường phản ứng": tổng hợp polysaccharid, lipid, protein và nucleic acid. Polysaccharid, lipid, protein và nucleic acid có khả năng tạo nên những phức hợp lớn là những thành phần của tế bào như thành tế bào, màng tế bào, enzyme và ribosome.

Thực vật và một số sinh vật tiền nhân có khả năng tổng hợp những phân tử hữu cơ từ những chất vô cơ nghèo năng lượng. Cũng như vậy đối với sự cố định nitơ vô cơ.

Nitơ ở dạng NH3, NO3- và một phần ở dạng N2 có thể được đồng hoá. Sự đồng hoá trực tiếp thực chất là sự kết hợp NH3 với một phân tử hữu cơ. Nitrate và N2 trước hết được chuyển sang NH3. Hai quá trình này sẽ được đề cập ở phần sau đây.

Quá trình khử nitrate và nitrite là chuyển NO3- thành NH3 qua NO2-, được xúc tác bởi 2 enzyme khác nhau là nitratreductase và nitritreductase.

Nitratreductase là 1 enzyme phổ biến trong vi khuẩn, nấm, thực vật bậc cao và thực vật bậc thấp. Ở những nhóm sinh vật khác nhau thì enzyme này có những đặc tính khác nhau. Chức năng chủ yếu là khử NO3- thành NO2-. Nhóm prosthetic của enzyme này ở thực vật bậc cao là FAD, cytochrome b và Mo. Trình tự phản ứng có phần tương tự chuỗi enzyme hô hấp, được biểu diễn ở trong hình 7.14. NADH, ở một số loài sinh vật là NADPH chuyển e- đến FAD, tạo thành FADH2, sau đó điện tử này được chuyển đến cytochrome b, cytochrome b ở trạng thái khử, khử Mo6+ thành Mo4+. Mo4+ có khả năng kéo 1 nguyên tử O của NO3- và khử để tạo thành NO2-. Oxy ở dạng khử phản ứng trực tiếp với proton để tạo thành H2O. Trong sơ đồ 2H+ được giải phóng ra trong quá trình oxy hoá khử giữa FADH2 và cytochrome b (hình 7.14).

Enzyme này định vị trong tế bào chất và dạng khử của nó được tạo nên từ quá trình đường phân (khử aldehydphosphoglyxeric thành phosphoglyxeric acid), ở thực vật C4 bằng sự oxy hoá malate thành oxaloacetate. Hoạt tính của enzyme nitratreductase bị ảnh hưởng mạnh bởi ánh sáng, nguyên nhân là do chất khử của nitratreductase được giải phóng trực tiếp từ lục lạp. Ở đây lục lạp tiếp nhận oxaloacetate hoặc phosphoglyxerate, trong quá trình quang hợp được khử thành malate và aldehydphosphoglyxeric. Hai chất này được đưa ra lại tế bào chất. Ở đây chúng bị oxy hoá có sự tham gia của NAD+ để tạo thành NADH. Cơ chế này đặc biệt có ý nghĩa ở thực vật C4, vì ở chúng một lượng đáng kể chất khử được tạo thành từ malate đi ra từ lục lạp.

Hoạt tính của enzyme nitratreductase bị ảnh hưởng bởi các chất khác nhau. Nitrate hoạt hoá mạnh mẽ, ngược lại NH4+ và các aminoacid kìm hãm enzyme này. Enzyme này có nửa thời gian tồn tại là một số giờ, vì vậy nó phải luôn luôn được tổng hợp mới. Sự tổng hợp này phụ thuộc vào cường độ ánh sáng.

Bên cạnh nitratreductase đồng hoá như đã nêu trên, người ta còn biết một loại nitratreductase hô hấp. Loại này có mặt chủ yếu trong vi sinh vật và được tạo nên đặc biệt trong điều kiện yếm khí. Chức năng của nó là khi không có O2, điện tử bắt nguồn từ chuỗi enzyme hô hấp kết hợp với nguyên tử O của NO3-. Trong trường hợp này NO3- thay thế nguyên tử oxy trong chuỗi hô hấp. Nitratreductase hô hấp này gắn chặt với màng và cùng tồn tại với cytochrome, bị ức chế bởi O2. Ngược với nitratreductase đồng hoá không kết hợp và mẫn cảm với O2, nitratreductase hô hấp là 1 enzyme xúc tác quá trình phản nitrate hoá . Phản nitrate hoá được hiểu là khử NO3- cho tới N2O và N2. Quá trình này xảy ra chủ yếu trong đất, nước trong điều kiện yếm khí và có vai trò quan trọng trong tự nhiên. Sự khử NO3- theo kiểu hô hấp tạo thành NO2- xảy ra trong hệ thống tiêu hoá người và động vật.

NO2- được tạo ra nhờ enzyme nitratreductase trong tế bào chất của tế bào thực vật là 1 anion của 1 acid yếu. Vì vậy một phần NO2- tạo nên được proton hoá và thể hiện ở cân bằng phương trình sau:

NO2- khó đi qua màng ngoài của ty thể và lạp thể, tuy nhiên dễ dàng đối với HNO2. Lục lạp và ty thể tiếp nhận chủ yếu HNO2 và như vậy đã làm cho tế bào chất bị kiềm hoá. Sự kiềm hoá này làm tăng sự tổng hợp các anion hữu cơ.

Trong ty thể xảy ra sự khử HNO2 thành NH3. Enzyme nitritreductase gồm 1 chuỗi polypeptide với 1 siroheme (cùng tồn tại Fe và S) và một phức hệ 4 nguyên tử Fe-S.

Trình tự phản ứng của nitritreductase được chỉ ra trong hình 7.15. Trong lục lạp chất khử trực tiếp là ferredoxin. Ở đây có một sự kết hợp chặt chẽ giữa quang hợp và khử nitrate.

Phản ứng xảy ra như sau:

Trong những cơ quan thực vật không có màu xanh, ví dụ như rễ cây, NO2- cũng được khử đến NH3. Một thời gian dài quá trình này đã không được giải thích, vì ở những bộ phận không có màu xanh, đặc biệt là rễ cây không có ferredoxin, cho đến khi những kết quả mới chỉ ra rằng, trong ty thể của rễ có 1 ferredoxin tương tự hệ thống oxy hoá khử có khả năng khử HNO2 thành NH3. Hệ thống khử này chứa chất khử là NADH hoặc NADPH.

Hoạt tính của nitritreductase được kích thích bởi nitrite và nitrate. Nồng độ nitritreductase cao hơn nồng độ nitratreductase, đó là nguyên nhân tại sao khi cung cấp nhiều nitrate cho cây dẫn đến sự tích luỹ nitrate mà không tích luỹ nitrite. Sự tích luỹ nitrate xảy ra khi thực vật được bón quá nhiều nitrate hoặc khi ánh sáng cho quang hợp yếu.

Trong trường hợp ánh sáng yếu dẫn đến sự thiếu chất khử. Đó là nguyên nhân tại sao đối với giống rau ba lăng những giờ buổi sáng thì có nồng độ nitrate cao hơn buổi chiều. Ban đêm chủ yếu là phosphoglyxerate và một ít triosephosphate đi ra khỏi lục lạp. Ban ngày thì ngược lại. Triosephosphate có khả năng khử NAD+ thành NADH khi phân giải theo quá trình đường phân để cung cấp chất khử cho quá trình khử nitrate. Ngược lại phosphoglyxerate không thể khử NAD+ và như vậy không cung cấp NADH cho quá trình khử nitrate.

Nồng độ nitrate cao thường gặp ở trong những bộ phận sinh trưởng dinh dưỡng và ở đây có thể ảnh hưởng đến sinh lý dinh dưỡng. Đặc biệt đối với những sản phẩm thực vật được dùng để ăn sống như xà lách, bắp cải, cà rốt. Thực ra nitrate không có hại nhưng trong quá trình bảo quản vi sinh vật biến đổi thành nitrite và trong cơ thể người, đặc biệt trong tuyến nước bọt nitrate được khử thành nitrite. Trong môi trường acid tạo thành HNO2, nó có thể được tách thành nitrosyl và hydroxyl.

Cation nitrosyl (NO+) có khả năng oxy hoá Fe2+ của hemoglobin bằng cách lấy đi 1e- của Fe

Hemoglobin ở dạng oxy hoá không thể kết hợp và vận chuyển O2, dẫn đến sự ngạt thở. Hiện tượng này gặp ở người trong một số tháng đầu vì sau đó cơ thể phát triển enzyme có khả năng khử hemoglobin ở dạng oxy hoá.

7.7 Quá trình cố định nitơ phân tử

Chỉ sinh vật tiền nhân mới có khả năng cố định N2, đó là 11 trong 47 họ vi khuẩn và 6 trong 8 họ vi khuẩn lưu huỳnh. Một số sống tự do, một số sống cộng sinh với thực vật bậc cao. Những vi sinh vật cố định đạm quan trọng nhất là:

- Rhizobium, sống cộng sinh với cây họ đậu.

- Bradyrhizobium, cũng sống cộng sinh với cây họ đậu, chúng khác với rhizobium ở chỗ là sinh trưởng chậm hơn.

- Loài frankia, vi khuẩn sống trong đất.

- Vi khuẩn lưu huỳnh heterocysten sống cộng sinh với các loài thực vật khác nhau như với bèo hoa dâu (azolla) ở lá.

Những loài vi sinh vật sống cộng sinh và tự do có chứa gen Nif trong hệ gen (Ni là viết tắt của nitrogen và f là fixing). Gen này mã hoá cho enzyme nitrogenase, là một đa enzyme, xúc tác cho phản ứng cố định N2, khử N2 thành NH3. Nitrogenase gồm 2 protein chứa Fe-S, protein nhỏ hơn có trọng lượng phân tử 60 kDa, chứa 1 chùm Fe-S có 4 nguyên tử, phân tử protein lớn hơn có trọng lượng phân tử 220 kDa và chứa nguyên tử S linh động, 36 nguyên tử Fe và 2 nguyên tử Mo. Phân tử protein nhỏ hơn có chức năng vận chuyển e-, trong đó e- của ferredoxin hoặc flavodoxin vận chuyển lên phức hệ Fe-Mo (hình 7.16).

Sự vận chuyển e- này cần năng lượng, do ATP cung cấp. ATP kết hợp với protein chứa Fe qua 1 cầu Mg và sau đó được thuỷ phân thành ADP và Pi. Sự thuỷ phân đã làm thay đổi hình dạng của protein enzyme, e- được vận chuyển lên phức hệ Fe-Mo. Để vận chuyển 1e- cần 2 ATP. Phức hệ Fe-Mo thực chất là 1 N2-reductase. Phức hệ nhỏ hơn được gạch chéo là 1 protein chứa Fe, phức lớn hơn là protein chứa Fe/Mo, phức lớn này thực chất là dinitrogen-reductase (hình 7.16).

Để vận chuyển e- từ phức Fe/Mo đến N2 thì sự thay đổi hoá trị Mo có một vai trò quan trọng, như ở hình 7.17.

2e- và 2H+ được kết hợp với nguyên tử Mo

Nguyên tử H2 đang gắn với enzyme bị đẩy ra bởi N2

N2 được khử thành -N=N do tiếp nhận H+ + e-

-N=N được khử thành =N-NH2 do tiếp nhận H+ + e-

=N-NH2 được khử thành NH3 do tiếp nhận H+ + e-, NH3 được tách ra khỏi phức hệ enzyme

6. Nguyên tử N đang gắn với enzyme được khử thành NH3 do tiếp nhận 3e- và 3H+ và sau đó NH3 được tách ra khỏi phức hệ.

Sự gắn N2 với phức hệ Fe-Mo cần 1 liên kết trước đó của phức hệ này với H2. Vì vậy kết quả là bên cạnh tạo ra NH3 ngoài ra còn xuất hiện H2, phân tử này có thể được tách ra thành H+ và e- và e- này được đưa trở lại hệ thống (hình 7.16).

Ở rhizobium và bradyrhizobium hệ thống nitrogenase được biểu diễn ở hình 7.15, hệ thống này định vị ở bacteroid được tìm thấy trong "không bào nhiễm" của những tế bào nốt sần. Bacteroid tương tự một cơ quan và có thể so sánh với ty thể. Nó được cung cấp các hợp chất carbon hữu cơ, chủ yếu là anion hữu cơ (succinate, malate, pyruvate) bởi tế bào chất của ký chủ, những chất này được tiếp tục phân giải trong chu trình Krebs. Ở đây xuất hiện NADH, được sử dụng một phần là chất cho điện tử ferredoxin và flavodoxin, một phần được sử dụng làm nguyên liệu của hô hấp. Hệ thống oxy hoá khử của chuỗi hô hấp cấu tạo nên màng. Chúng cung cấp ATP và ATP cần cho sự hoạt hoá enzyme nitrogenase. Chuỗi hô hấp được cung cấp O2 bởi leghemoglobin. Phức hệ protein chứa heme có trong không bào nhiễm này có thể so sánh với myoglobin trong mô cơ hoặc hemoglobin trong máu. Nó cung cấp O2 cho chuỗi enzyme hô hấp và nó kiểm soát O2 đi vào bacteroid. Sự kiểm soát này rất quan trọng, vì enzyme này bị ức chế bởi O2.

NH3 được tạo nên bởi nitrogenase được đưa đến tế bào chất của tế bào chủ và ở đây được sử dụng để tổng hợp nên aminoacid. Sự tổng hợp enzyme nitrogenase được điều khiển bởi enzyme glutamate synthetase, xúc tác cho tổng hợp glutamin từ NH3. Nếu trong hệ thống có ít NH3 thì glutamate synthetase kích thích tổng hợp nitrogenase, nồng độ NH3 cao thì ức chế sự tổng hợp nitrogenase. Cơ chế điều khiển này rất có ý nghĩa, tuy nhiên khi cung cấp NH3 dư thừa thì nitrogenase không được sử dụng, vì đã có đủ NH3. Vì vậy bón phân đạm ức chế sự tạo thành nốt sần của cây họ đậu. Ở vi khuẩn rhizobium sống cộng sinh, NH3 tạo thành được đưa nhanh đến tế bào chủ, nên sự tổng hợp nitrogenase hầu như không bị kìm hãm. Hơn nữa vi khuẩn trong tế bào chủ luôn được cung cấp bởi những anion hữu cơ. Đó là những nguyên nhân quan trọng nhất, tại sao sự cộng sinh vi khuẩn/cây họ đậu có tỷ lệ cố định N2 cao. Ví dụ cây cỏ (trifolium pratence) sống cộng sinh với vi khuẩn trong điều kiện sinh trưởng tốt có thể cố định 300-400 kg N/ha/năm. Vi khuẩn sống tự do tỷ lệ cố định nitơ bị ảnh hưởng do sự tích luỹ NH3 ở trong tế bào vi khuẩn và sự cung cấp không đầy đủ carbon hữu cơ. Loài vi khuẩn cố định nitơ sống tự do cần cho sự trao đổi chất của chúng những hợp chất hữu cơ dễ phân giải, như đường và các acid hữu cơ, thường có trong đất với lượng không đủ. Vì vậy khả năng cố định đạm của vi khuẩn sống tự do cơ bản là thấp. Những vi khuẩn lưu huỳnh tự dưỡng thuộc loài anabaena, nostoc và rivularia tự đồng hoá CO2 bằng quang hợp và cố định N2. Khả năng cố định N2 bị ảnh hưởng rất nhiều khi nồng độ O2 cao.

7.8 Các đường hướng biến đổi NH3- chu trình ornithine

Sự khử nitrate-nitrite và hệ thống nitrogenase sản sinh NH3, sau đó NH3 kết hợp với một phân tử hữu cơ, thường là a-cetoglutaric acid hoặc glutamic acid. Xúc tác cho phản ứng gắn NH3 này ở thực vật bậc cao và bậc thấp là glutmate synthetase (GS), enzyme này thường hoạt động trong một nhóm. Glutmate synthetase là một protein có 8 tiểu đơn vị với trọng lượng phân tử từ 350 đến 400 kDa. Người ta biết có 2 loại enzyme đồng phân, một loại có trong tế bào chất (GS1) và một loại có trong lục lạp. Phản ứng do glutmate synthetase xúc tác như sau:

Chất nhận NH3 là glutamate. Trong phản ứng, enzyme được phosphoryl hoá (kinase) và sau đó được khử phosphoryl hoá (phosphatase). Cả hai phản ứng về tổng quan là sự thuỷ phân ATP. Sản phẩm phản ứng là glutamine, một amide. Một phân tử tương tự glutamine là asparagine, được tạo nên tương tự glutamine. Tuy nhiên nó không phải là chất nhận NH3 quan trọng.

Vai trò trung tâm của glutmate synthetase đối với sự đồng hoá NH3 được giải thích glutamine là chất cho nhóm NH2 khi tổng hợp glutamate. Ở đây a-cetoglutaric acid là chất nhận, được chỉ ra như sau:

Các chất tham gia phản ứng trao đổi 1 nhóm NH2 với nguyên tử O. Ở mỗi sản phẩm tạo thành thiếu 1 nguyên tử H, được ferredoxin hoặc NAD(P)H cung cấp. Bằng cách này từ glutamine và a-cetoglutaric acid 2 phân tử glutamate được tạo nên. Quá trình này gồm sự chuyển nhóm amine và sự khử và phản ứng được xúc tác bởi glutamate synthetase.

Glutamate synthetase có hai loại isoenzyme có cấu tạo khác nhau. Glutamate synthetase phụ thuộc vào ferredoxin là 1 flavoprotein chứa Fe-S có trọng lượng phân tử 140-230 kDa, enzyme này có trong lục lạp, nhận chất khử qua ferredoxin trực tiếp từ quang hợp. Glutamate synthetase có trong tế bào chất có trọng lượng phân tử khoảng 240 kDa. Chất khử của nó là NADH (từ đường phân) hoặc NADPH (từ oxy hoá trực tiếp glucose). Cả 2 enzyme glutamate synthetase và glutamine synthetase hoạt động trong 1 nhóm, làm cho quá trình phản ứng thành 1 vòng tròn, như hình 7.18.

Tổng quát chu trình chỉ ra rằng a-cetoglutaric acid được amine hoá nhờ NH3 với sự tiêu tốn 1 ATP và 2e-. a-cetoglutaric acid (oxoglutarate) có nguồn gốc từ chu trình Krebs. Sản phẩm của phản ứng là glutamate, có ý nghĩa quan trọng, vì nhờ chuyển amine hoá mà nhóm amine được chuyển đến một chất khác (cetoacid, aldehyd). Hầu hết nitơ có trong thực vật xảy ra qua phản ứng này, một lần có trong nhóm amine của glutamate. Glutamate synthetase là 1 glutamine-oxoglutarate-aminotransferase, được gọi tắt là GOGAT. Vì vậy người ta gọi chu trình tổng hợp glutamate là con đường phản ứng GOAGT.

Những enzyme của chu trình tổng hợp glutamate đặc biệt có nhiều ở trong những tế bào của nốt sần. Ở đây những phân tử NH3 được cung cấp bởi bateriod của vi khuẩn nốt sần được đồng hoá qua chu trình này. Con đường GOAGT cũng có ý nghĩa trong lục lạp của thực vật C3. NH3 được giải phóng ra một lượng lớn ở trong hô hấp sáng, nếu NH3 này bay ra không khí thì đây là một sự mất mát lớn đối với thực vật. NH3 giải phóng ra được tiếp nhận bởi chu trình tổng hợp glutamate và nitơ của nó được sử dụng lại trong trao đổi chất của thực vật ở dạng aminoacid.

Đã lâu người ta cho rằng enzyme glutamate dehydrogenase (GDH) cũng có ý nghĩa đối với sự đồng hoá NH3 trong thực vật. Glutamate dehydrogenase xúc tác cho phản ứng sau:

Đây là sự khử amine hoá oxy hoá, là một quá trình giải phóng NH3, ngược với quá trình đồng hoá NH3. Tuy nhiên khi nồng độ NH3 cao thì nó sẽ gây độc cho thực vật. Đối với nhiều loài vi sinh vật sự đồng hoá NH3 nhờ GDH có ý nghĩa. Trong thực vật GDH có chủ yếu trong ty thể. NADH mà nó tạo ra có thể đi vào chuỗi hô hấp, NH3 có thể được sử dụng cho tổng hợp asparagine nhờ enzyme asparaginsynthetase theo phương trình sau:

Chất nhận NH3 là aspartate. Phản ứng này tương tự phản ứng tổng hợp glutamine. Glutamate dehydrogenase có tương đối nhiều trong mô rễ và những mô đã già. Vì vậy người ta cho rằng, ở đây nó sản sinh NH3 và là điều kiện để tổng hợp asparagine, là dạng nitơ vận chuyển và được vận chuyển ra khỏi những mô này.

7.9 Các đường hướng tổng quát của sự biến đổi aminoacid

Các aminoacid về cơ bản được sử dụng để tổng hợp protein song cũng có thể chịu những sự biến đổi khác. Đó là phản ứng theo nhóm amine carboxyl và phản ứng theo gốc R của aminoacid.

- Các phản ứng theo nhóm a-amine: là các phản ứng phân giải aminoacid thành NH3 và các sản phẩm tương ứng theo 4 hướng cơ bản sau:

Khử amine hoá bằng cách thuỷ phân

b. Khử amine hoá bằng cách khử

c. Khử amine hoá bằng cách oxy hoá

Phản ứng này tiến hành qua 2 giai đoạn: trước hết aminoacid bị loại hydro để tạo thành iminoacid tương ứng với sự tham gia của enzyme dehydrogenase

Tiếp đó iminoacid kết hợp với phân tử H2O, NH3 bị loại trừ và giải phóng cetoacid

d. Khử amine hoá bằng cách chuyển hoá nội phân tử.

Trong các phản ứng trên thì phản ứng amine hoá bằng cách oxy hoá là phổ biển trong thực vật so với đường hướng khác. Các a-cetoacid đều là sản phẩm chủ yếu của sự khử amine hoá các aminoacid.

- Các phản ứng theo nhóm carboxyl: diễn ra chủ yếu theo hai quá trình: sự khử carboxyl hoá và sự tạo thành aminoacyl adenylate

a. Quá trình khử carbocyl hoá các aminoacid

Quá trình này được thực hiện trong các động vật, thực vật và đặc biệt là phổ biến trong cơ thể sinh vật. Sự khử carboxyl tiến hành theo sơ đồ sau:

Sản phẩm phản ứng là các amine. Mỗi một aminoacid riêng biệt được xúc tác bởi một enzyme decarboxylase tương ứng.

Sản phẩm của sự khử carboxyl hoá các aminoacid là amine, diamine, CO2, NH3 và các hợp chất khác. Trừ CO2, NH3, tất cả các hợp chất khác đều bị phân giải tiếp tục. Nếu trong điều kiện bất lợi thì các amine và diamine tích tụ lại gây độc cho cây, trong điều kiện bình thường chúng sẽ bị oxy hoá dưới tác dụng của enzyme oxydase để tạo thành NH3 và các aldehyd.

Các acid và aldehyd lại bị oxy hoá tiếp tục để tạo thành CO2, H2O và NH3. Các sản phẩm này chính là sản phẩm cuối cùng của sự phân giải aminoacid.

b. Phản ứng theo nhóm carbocyl là quá trình tạo thành phức hợp aminoacyl-adenylate. Chi tiết cơ chế của phản ứng này trong phần sinh tổng hợp protein.

- Những chuyển hoá của phân tử aminoacid có liên quan đến gốc R trong phân tử.

Do tính muôn màu muôn vẻ của gốc R nên các phản ứng hoá học của chúng vô cùng phong phú và đa dạng. Nhiều phản ứng được thực hiện trong quá trình trao đổi aminoacid, trong đó quan trọng nhất là các phản ứng biến đổi từ một aminoacid này thành một aminoacid khác. Nhờ đường hướng này mà khả năng tổng hợp các aminoacid tăng lên rất nhiều.

Sau đây chỉ nêu lên một số ví dụ:

Khi oxy hoá phenylalanine sẽ tạo thành tyrosine

Thuỷ phân arginine thì ornithine được tạo thành và từ ornithine sẽ thu được proline hoặc glutamic acid.

Khi oxy hoá nhóm -SH của cysteine sẽ thu được cystine

Từ threonine nếu loại trừ gốc acetaldehyd sẽ thu được glycine.

7.10 Sinh tổng hợp protein

Tham gia vào sư tổng hợp polypeptide và protein có mRNA, tRNA, rRNA, trong đó rRNA là thành phần của ribosome. Với sự tổng polypeptite thông tin di truyền được chuyển từ DNA đến polypeptide. Trước khi nghiên cứu quá trình tổng hợp protein cần phải đề cập đến từng nucleic acid và ribosome.

1. Nguyên liệu để tổng hợp polypeptide là các aminoacid. Để tham gia vào phản ứng chúng phải được hoạt hoá nhờ ATP, tạo nên AMP-aminoacyl = aminoacid hoạt hoá

2. Aminoacyl được chuyển lên tRNA.

3. tRNA vận chuyển aminoacyl đến ribosome. Ở đây aminoacyl có thể tạo liên kết peptide.

4. mRNA được tổng hợp trong nhân tế bào rồi đi đến ribosome, là nơi tổng hợp polypeptide. mRNA mang thông tin cho chuỗi polypeptide được tổng hợp, xác định trình tự của aminoacid trong chuỗi polypeptide.

Thông tin di truyền trong mRNA thể hiện ở trình tự base của chúng và ba nucleotide đứng cạnh nhau mã hoá cho một aminoacid xác định. Các bộ ba này được gọi là codon. Dưới đây là các codon của một đoạn mRNA mã hoá cho alanine, aspartic acid, cysteine và serine.

Ngày nay những codon mã hoá cho các aminoacid cấu tạo nên protein đã được biết. Điều rất thú vị là các mã di truyền cho tất cả mọi sinh vật từ sinh vật nhân sơ đơn giản nhất cho đến những động vật có vú là như nhau. Tuy nhiên cũng có một số ngoại lệ như ở ty thể người. Qua bảng mã di truyền ta thấy phần lớn các aminoacid được mã hoá bởi hai codon, và các codon đó có hai base nitơ đầu tiên giống nhau.

Ribosome được tạo nên từ rRNA và protein. Ở sự kết hợp này có sự tham gia của Mg+. Ribosome được tạo nên từ 1 tiểu phần lớn và 1 tiểu phần nhỏ. Độ lớn của các tiểu phần được đặc trưng bởi hệ số lắng S ( hệ số Svedberg).

X là khoảng cách của trục ly tâm

v = vận tốc gốc

t là thời gian

dx/dt, khoảng cách mà tiểu phần di chuyển trong đơn vị thời gian. Khoảng cách này càng dài khi tiểu phần càng nặng.

Hệ số lắng S đối với protein có độ lớn từ 1 x 10-13 đến 200 x 10-13. Sự biến đổi đơn vị hệ số lắng của Svedberg là nhân với 1013, tương ứng hệ số lắng của protein là 1-200. S càng lớn thì tiểu phần đó càng lớn (càng nặng). Bảng 7.7 chỉ hệ số lắng của các tiểu phần ribosome khác nhau và của nucleic acid.

Bảng 7.7 Hệ số lắng của các phân tử khác nhau và các kết hợp (S)

Bảng 7.8 Các rRNA của ribosome của tiểu phần lớn và nhỏ của sinh vật nhân chuẩn và nhân sơ:

Bảng 7.8 cho biết độ lớn của ribosome và các tiểu đơn vị ribosome. Dựa trên đơn vị S này ta thấy ribosome của sinh vật tiền nhân nhỏ hơn sinh vật nhân chuẩn.

Ribosome ở trong ty thể và lạp thể tương tự về độ lớn và chức năng như ribosome ở sinh vật tiền nhân. Hai tiểu phần của ribosome được gắn với mRNA, nghĩa là khi không có mRNA thì hai tiểu phần không kết hợp với nhau mà ở trạng thái riêng lẽ.

Cấu trúc không gian hai chiều tRNA tương tự lá cỏ tam điệp. Tuy nhiên tRNA có cấu trúc không gian ba chiều, vì vậy phức tạp hơn và được biểu diễn theo sơ đồ ở hình 7.21.

Trong tRNA có một số base nitơ lạ như cytosine và guanine đã methyl hóa đó là pseudouridine, dihydrouracil và hypoxanthine.

Pseudouridine liên kết với ribose không phải N-glycosid mà là C-glycosid (ở vị trí C6 của uracil). Vì đây là những base nitơ lạ nên ở các vị trí khác nhau của tRNA không có sự cặp đôi các base. Ý nghĩa đặc biệt hơn về chức năng của tRNA là có vị trí "anticodon" và "chỗ kết hợp của aminoacyl".

Chỗ kết hợp của aminoacyl của tất cả các phân tử tRNA là như nhau, đó là trình tự cytosine-cytosine-adenine. Aminoacyl được kết hợp vào ribose của adenine. Anticodon đặc trưng cho từng loại aminoacid, là những base bổ sung cho codon ở trên mRNA. Anticodon được đọc từ phải sang trái. Đặc tính của anticodon là hai base đầu tiên đặc hiệu đối với aminoacid. Base thứ ba có thể là khác nhau, nó có thể "linh động", có nghĩa là không tạo cầu hydro với cođon. Ở bảng sau anticodon C-A (codon = G-U) mã hoá cho aminoacid valine.

Inosine là một nucleoside được tạo nên từ hypoxanthine và ribose. Một aminoacid có nhiều tRNA đặc hiệu. Trình tự của một tRNA đặc hiệu cho một aminoacid nhất định có thể là khác nhau. Sự khác biệt trong cấu trúc bậc một của tRNA giữa nấm men và chuột được khẳng định.

Trước khi aminoacid được sử dụng để tổng hợp protein chúng phải được hoạt hoá nhờ ATP, ATP kết hợp với aminoacyl và pyrophosphate được tách ra (hình 7.22).

Ở đây xuất hiện một adenosinphosphataminoacyl (aminoacid đã hoạt hoá). ATP cung cấp năng lượng cần thiết cho quá trình tổng hợp. Adenosinphosphataminoacyl mang gốc acyl ở ribose cuối cùng của tRNA. Nó kết hợp với aminoacyl ở vị trí carbon thứ 3 của ribose đồng thời giải phóng AMP. Như vậy aminoacyl liên kết với chất mang đặc hiệu và vận chuyển chúng đến vị trí tổng hợp protein. Toàn bộ quá trình hoạt hoá aminoacid và kết hợp aminoacyl với tRNA được xúc tác bởi một enzyme aminoacyl-tRNA-synthetase. Ribosome, mRNA và tRNA-aminoacyl tạo điều kiện cho việc tạo liên kết peptide. Theo kết quả thí nghiệm ở vi khuẩn, đặc biệt là E.coli thì quá trình xảy ra như sau: Tiểu đơn vị nhỏ của ribosome kết hợp với gốc phosphate của mRNA cùng với một tRNA-aminoacyl. Chúng được gọi là "phức hệ khởi đầu" và sau đó mới có khả năng kết hợp với tiểu phần lớn của ribosome, tạo ra bộ máy tổng hợp polypeptide. Tiếp theo một phân tử tRNA-aminoacyl thứ hai kết hợp với ribosome và đảm bảo tRNA-aminoacyl ở đúng vị trí của mình (hình 7.23). Vị trí chính xác là base nitơ của codon được kết hợp bổ sung với base nitơ ở anticodon.

- Amino acid được hoạt hoá bằng cách gắn với tRNA riêng của nó. Quá trình này gồm 2 phản ứng, được xúc tác bởi cùng một enzym đặc hiệu đối với mỗi amino acid, đó là các amino acid-tRNA-synthetase. Như vậy có 20 amino acid thì cũng có 20 loại enzyme khác nhau.

Trong phản ứng thứ nhất amino acid phản ứng với ATP tạo nên AMP-aminoacyl và 1 pyrophosphate (hình 7.22, phản ứng 1). Hợp chất được tạo nên bởi nhóm carboxyl của amino acid và một gốc phosphoric acid và gắn với enzyme nên có khả năng phản ứng cao.

Trong phản ứng thứ hai, nó sẽ phân li, cho phép aminoacyl từ AMP-aminoacyl được vận chuyển đến tRNA. Ở đây aminoacyl thay thế H của nhóm OH ở vị trí carbon thứ 3 tạo thành aminoacyl-tRNA.

- Ở giai đoạn khởi đầu tổng hợp chuỗi polypeptide cần có hai điều kiện: Một là trên mRNA có một khu vực không mã hoá, đó là dấu hiệu kết hợp với ribosome mở đầu cho vùng mã hoá. Hai là có bộ mã khởi đầu AUG làm điểm xuất phát. Ở vi khuẩn đôi khi thấy mã khởi đầu GUG thay cho AUG.

Như ta đã biết bộ mã AUG mã hoá cho methionine. Ở vi khuẩn, người ta thấy có hai loại tRNA đối với methionine: một là tRNA nhận gốc methionine để đưavào thành phần của chuỗi polypeptide Met-tRNA, hai là tRNA nhận gốc formyl-methionine (fMet-tRNA) có vai trò quan trọng trong việc khởi đầu tổng hợp chuỗi polypeptide. Ở sinh vật nhân sơ, nhóm amine của methionine có thể được formyl hoá bởi N10-formyl-tetrahydrofolic acid, nhờ enzyme transformylase đặc hiệu. Do nhóm amine đã bị gốc formyl bao vây nên không cho phép nó tham gia vào quá trình kéo dài chuỗi, mà chỉ tham gia vào quá trình khởi đầu tổng hợp protein.

Ở sinh vật nhân sơ anticodon được định vị ở giữa của 16SrRNA. Base bổ sung kết hợp với base của codon mRNA ở khoảng cách từ 0,3 đến 0,4 nm, như vậy sẽ xuất hiện lực hấp dẫn Van der Waal. Bằng cách này trước hết tRNA-aminoacyl kết hợp với tiểu phần nhỏ của ribosome và thực chất là với mRNA. Phức hệ này phản ứng với "nhân tố kéo dài". Nhân tố này có trên tiểu phần lớn của ribosome.

Ở sinh vật nhân sơ, ngoài các yếu tố tham gia khởi đầu tổng hợp protein như fMet-tRNA, mRNA, các tiểu đơn vị ribosome 30S và 50S, GTP, còn có 3 protein nữa là các yếu tố khởi đầu: IF1 (M 9000), IF2 (M 65000-80000) và IF3 (M 29000). Kết quả của giai đoạn này là tạo thành phức hợp khởi đầu: fMet-tRNA-mRNA-ribosome 70S.

Quá trình được bắt đầu bằng sự kết hợp giữa yếu tố IF3 với tiểu đơn vị 30S. Nhờ yếu tố này mà tiểu đơn vị 30S kết hợp với mRNA ở vị trí khởi đầu. Trong giai đoạn hai fMet-tRNA gắn với phức IF2-GTP để tạo thành IF2-GTP-fMet-tRNA (tổ hợp 3). Ở giai đoạn ba và bốn phức hợp IF3-30S kết hợp với tổ hợp 3. Nhờ yếu tố IF2 mà fMet-tRNA được đưa vào khu vực P. Người ta chưa biết chính xác vai trò của IF1, có thể nó tham gia vào việc đổi mới chu trình bằng cách góp phần giải phóng yếu tố IF2 ra khỏi phức hợp. Cuối cùng tiểu đơn vị 50S kết hợp với tiểu đơn vị 30S để tạo ra phức hợp ribosome 70S, đồng thời giải phóng cả 3 yếu tố khởi đầu cũng như giải phóng cả GDP và Pi.

Ở sinh vật nhân chuẩn, quá trình tổng hợp polypeptide trong tế bào chất có tRNA khởi đầu cũng mang methionine nhưng không được formyl hoá. Ở đây cũng có các phản ứng với các yếu tố khởi đầu eIF1, eIF2 và eIF3 tương tự như ở sinh vật nhân sơ.

Trên tiểu phần lớn có ba vùng quan trọng: vùng A: là nơi tRNA-aminoacyl được kết hợp, vùng P: nơi gắn tRNA-peptidyl và vùng E: thực hiện sự kéo dài chuỗi peptide (hình 7.23).

- Ở giai đoạn kéo dài chuỗi polypeptide, amino acid thứ hai (do mã tiếp theo của mRNA quy định) gắn với tRNA riêng của nó sẽ được đưa vào phức hợp khởi đầu ở vùng A. Giai đoạn này cần GTP và các yếu tố kéo dài chuỗi. Ở sinh vật nhân sơ yếu tố kéo dài là EF-T (gồm 2 bộ phận hợp thành là EF-Tu và EF-Ts). Yếu tố này ở sinh vật nhân chuẩn là eEF-1. Các yếu tố này là những protein: EF-Tu (M 43000), EF-Ts (M 74000). Chúng có vai trò đưa aminoacyl-tRNA vào vùng A của ribosome thông qua các bước sau:

EF-Tu + GTP ® EF-Tu. GTP (tổ hợp hai)

EF-Tu.GTP + amonoacyl-tRNA ® aminoacyl-tRNA-EF-Tu-GTP (tổ hợp ba).

Tổ hợp ba chỉ kết hợp với vùng A trong ribosome vì vùng P đã có fMet-tRNA (ở giai đoạn sau là peptidyl-tRNA) chiếm chỗ.

Đây là giai đoạn quyết định bảo đảm định hướng đúng để tạo ra liên kết peptide giữa aminoacyl-tRNA và peptidyl-tRNA.

Trước khi aminoacyl được gắn kết vào peptidyl thì nó kết hợp với GTP ở vùng E của ribosome để tạo nên một phức gồm ba yếu tố. Sau khi GTP thuỷ phân thì liên kết peptide được tạo thành. Quá trình này được xúc tác bởi enzyme peptidyltransferase, chuyển peptidyl đến tRNA-aminoacyl vừa kết hợp vào (hình 7.24). Enzyme này được cấu tạo chủ yếu từ rRNA. Phần phi protein 50S rRNA thể hiện đầy đủ hoạt tính của peptidyltransferase. Nucleic acid có hoạt tính enzyme được gọi là ribozyme. Protein của ribosome tham gia quá trình enzyme là do sự thay đổi cấu hình. Đối với hình thể của từng thành phần ribosome ion Mg+ có một ý nghĩa quan trọng.

Sau khi kết hợp với ribosome, GTP bị thuỷ phân đồng thời giải phóng tổ hợp EF-Tu-GDP ra khỏi ribosome. Phức hợp EF-Tu-GDP khi tác động tương hỗ với EF-Ts và GTP sẽ lại biến thành EF-Tu-GTP. Do đó nó có thể lai tương tác với aminoacyl-tRNA tiếp theo. Các nghiên cứu cho thấy số lượng yếu tố EF-Tu bằng khoảng số lượng phân tử aminoacyl-tRNA. Từ đó người ta cho rằng phần lớn các aminoacyl-tRNA là nằm trong thành phần tổ hợp ba chứ không phải ở trạng thái tự do.

Hình 7.24 biểu diễn sự hình thành liên kết peptit. Vị trí "A" ở ribosome là vùng nhận, vị trí "P" là vùng cho. Ở vùng nhận kết hợp với tRNA-aminoacyl mới đi vào (aminoacyl với R0 ở hình 7.24). Ở vùng cho thì tRNA-aminoacyl đã kết hợp với ribosome cũng như tRNA-polypeptidyl. tRNA-polypeptidyl mang một chuỗi polypeptide với hai aminoacid (R1 và R2). Ở vị trí này cả hai thành phần tRNA-aminoacyl và tRNA-polypeptidyl tham gia phản ứng: nguyên tử H của nhóm amine của aminoacid gắn kết với polypeptidyl ở ribose của tRNA bằng liên kết ester. Chuỗi polypeptidyl được chuyển từ chất cho đến chất nhận. tRNA gắn ở vùng cho bây giờ ở trạng thái tự do, nghĩa là ribose cuối cùng của nó có nhóm OH ở vị trí C3 tự do. Lúc này chuỗi polypeptide dài thêm một đơn vị (aminoacyl) (hình 7.24, bên phải). Đây là phản ứng vận chuyển peptidyl. Bằng cách này liên kết peptide được tạo nên và tRNA được gắn kết trước đó trở nên tự do.

Phản ứng kéo dài chuỗi cần có sự tham gia của GTP và một yếu tố kéo dài khác là EF-G (ở sinh vật nhân chuẩn là eEF-2). Yếu tố EF-G là một trong những yếu tố cơ bản của tế bào, có khối lượng phân tử 72000. Yếu tố này khi kết hợp với ribosome góp phần tạo cho ribosome chuyển dịch một khoảng cách bằng một bộ ba trên phân tử mRNA, khi đó peptidyl-tRNA chuyển từ vùng A sang vùng P.

Sau khi kết hợp ribosome dịch chuyển đến codon tiếp theo, tRNA mang aminoacid tiếp theo được kết hợp vào. Ribosome là hệ thống cơ hoá học có khả năng chuyển động tương tự như protein cơ.

- Giai đoạn kết thúc: Quá trình tổng hợp sợi polypetide kết thúc khi ở trên mRNA có một codon kết thúc xuất hiện hoặc là đã đến đầu cuối của mRNA. Những codon kết thúc là UAA, UAG và UGA. Sợi polypeptide tách khỏi ribosome và tự động hình thành cấu trúc bậc bốn. Sau đó ribosome bị phân ly thành các tiểu đơn vị 30S và 50S rồi nhập vào kho dự trữ ribosome. Sự nhận biết các bộ mã kết thúc được thực hiện bởi các yếu tố kết thúc. Đó là các protein, ở sinh vật nhân sơ là RF1 (M 4000) nhận biết bộ mã UAA và UAG và RF2 (M 47000) nhận biết mã UAA và UGA. Ở sinh vật nhân chuẩn có một yếu tố kết thúc là eRF. Để thực hiện phản ứng giải phóng chuỗi polypeptide thì peptidyl-tRNA phải nằm ở vùng P, còn các yếu tố kết thúc tương tác với vùng A của ribosome.

Bằng cách này hướng tổng hợp của sợi polypeptide được xác định, vì aminoacid chỉ có thể được kết hợp với nhóm carbonyl mà không kết hợp với nhóm amine. Ở sinh vật nhân chuẩn sự tổng hợp polypeptide cũng bắt đầu bằng methionine, không được formyl hoá. Methionine và methionine được formyl hoá sẽ tách ra bằng thuỷ phân khi quá trình tổng hợp polypeptide kết thúc.

Quá trình tổng hợp protein xảy ra ở ribosome của tế bào chất và ty thể, lạp thể. Chúng có hệ thống tổng hợp protein riêng và có những enzyme cần thiết cho quá trình đó. Tuy nhiên ở trong ty và lạp thể không có đủ tất cả các loại enzyme.

Trong nhiều trường hợp một sợi mRNA thực hiện giải mã trên nhiều ribosome, như vậy cùng một sợi mRNA có từ 20 đến 40 protein được tổng hợp. Sự tập hợp một loạt ribosome trên một sợi mRNA được gọi là polysome. Ở hình 7.25 biểu diễn sự sắp xếp của các ribosome. Trên sơ đồ cho thấy những ribosome nào đã trượt xa nhất trên sợi mRNA thì sợi polypeptide được tạo nên là dài nhất.

Một số kháng sinh có thể ảnh hưởng đến quá trình sao chép và giải mã. Quá trình sao chép bị ức chế bởi actinomycin D và rifamycin. Chất thứ nhất phong toả base nitơ guanine, chất thứ hai ức chế RNA-polymerase. Quá trình giải mã bị ức chế bởi puromycin, streptomycin và chloramphenicol và thực ra là chúng kết hợp với vùng phản ứng của ribosome. Kháng sinh cũng kìm hãm qúa trình tổng hợp protein của vi sinh vật.

Từ các vấn đề nêu trên ta có nhận xét rằng: quá trình sinh tổng hợp protein vô cùng phức tạp, có sự tham gia của nhiều yếu tố. Người ta đã xác nhận có tới hàng trăm yếu tố tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein trong tế bào.

Về mặt năng lượng, quá trình sinh tổng hợp là một quá trình thu năng lượng. Ở vi khuẩn cũng như ở sinh vật nhân chuẩn, nhu cầu năng lượng cho quá trình là rất lớn. Để đưa một amino acid vào chuỗi polypeptide cần chi phí 3 liên kết cao năng:

- 1 ATP cho hoạt hoá amino acid ở giai đoạn đầu

- 1 GTP để đưa amonoacyl-tRNA (trong tổ hợp ba) vào vùng A của ribosome

- 1 GTP cần để ribosome di chuyển một bộ ba trên mRNA

Do giai đoạn khởi đầu còn cần 1 GTP tham gia, nên để tổng hợp liên kết peptide đầu tiên phải sử dụng tới 4 liên kết cao năng.

Người ta cho rằng phân tử GTP tham gia vào quá trình này có hai chức năng: một là tạo cấu hình thích hợp cần thiết cho sự tương tác tiếp theo, hai là bảo đảm năng lượng để ribosome di chuyển trên mRNA.

Về mặt tốc độ, quá trình tổng hợp protein xảy ra rất nhanh và phụ thuộc vào nhiệt độ. Ở vi khuẩn ở nhiệt độ 370C trong một giây chuỗi polypeptide tăng từ 12 đến 17 aminoacid. Vì vậy, để tổng hợp 1 phân tử protein trung bình có độ lớn 300 aminoacid mất khoảng 20 giây. Trong tế bào sinh vật nhân chuẩn, tốc độ tổng hợp chậm hơn, ví dụ trong tế bào hồng cầu lưới ở 370C tốc độ kéo dài chuỗi peptide là 2 aminoacid trong 1 giây. So với tốc độ giai đoạn kéo dài chuỗi thì giai đoạn khởi đầu và kết thúc xảy ra chậm chạp hơn.

7.11 Sự phân giải các hợp chất chứa nitơ

Sự phân giải protein, như ở trong hệ tiêu hoá của động vật, ở hạt nảy mầm hoặc ở trong đất khi phân giải các hợp chất hữu cơ nhờ vi sinh vật, bắt đầu bằng sự thuỷ phân. Các liên kết peptide bị cắt ra do các peptidase, xuất hiện các aminoacid tự do. Tuỳ thuộc vào loại peptidase mà chuỗi peptide được thuỷ phân ở giữa hoặc ở một đầu chuỗi.

Ở quá trình nảy mầm các aminoacid được tạo ra được sử dụng để tổng hợp nên các protein mới. Sự phân giải protein nhờ vi sinh vật trong đất và trong hệ tiêu hoá được thực hiện tiếp theo là các aminoacid bị khử amine hoá, giải phóng ra NH3. Những vi sinh vật sống trong đất có khả năng thực hiện phản ứng này vì vậy được gọi là vi sinh vật tạo amôn.

Nguyên tắc của sự khử amine hoá là phản ứng oxy hoá và sự tách NH3 (khử amine hoá oxy hoá). Ở trong động vật, đặc biệt là glutamate được sự khử amine hoá bằng cách oxy hoá. Enzyme xúc tác cho phản ứng này là glutamate dehydrogenase. Trong điều kiện yếm khí những aminoacid bị khử amine hoá bằng phản ứng khử (xem sơ đồ), một quá trình xảy ra trong đất ngập nước, như đất lúa.

Trong cơ thể động vật có vú urê được tạo ra từ NH3 qua chu trình được gọi là ornithine (hình 7.26). Trong chu trình này gốc carbamyl và guanidyl đóng vai trò quan trọng. Cả hai đều xuất phát từ urê, như công thức sau:

Chu trình bắt đầu với sự tổng hợp carbamic acid (xem sơ đồ). Đây là phản ứng cân bằng tự nhiên. Chất phản ứng được cung cấp do quá trình hô hấp (CO2) và quá trình khử amine hoá bằng cách oxy hoá (NH3). Carbamic acid được phosphoryl hoá nhờ ATP để tạo thành carbamylphosphate:

Carbamylphosphat phản ứng với ornithine để tạo citrulline và phosphate vô cơ được tách ra.

Ở đây nguyên tử H của nhóm amine cuối cùng được thay thế bằng nhóm carbamyl. Citrulline phản ứng với aspartic acid để tạo thành argininosuccinic acid. Phản ứng cần ATP.

Qua sự biến đổi nội phân tử chất này được tách thành arginine và fumaric acid.

Arginine là 1 dẫn suất của guanidyl. Nhờ arginase (hydrolase) arginine được tách ra thành ornithine và urê.

Sau khi tạo thành ornithine chu trình mới lại bắt đầu. Chất đi vào chu trình: CO2, NH3, asparagine và ATP. Chu trình tạo nên urê và fumaric acid. Hai nguyên tử N của urê bắt nguồn từ NH3 và asparagine. Như vậy NH3, dạng độc đã được biến đổi thành dạng không độc, và được thải ra cùng với nước tiểu. Fumaric acid là chất trao đổi của chu trình Krebs và cũng được tiếp tục biến đổi ở đó. Việc sử dụng ATP ở đây đã nói lên rằng, việc giải độc NH3 cần năng lượng. Khung carbon của fumaric acid bắt nguồn từ asparagine. Như vậy một aminocid trong quá trình phân giải của chu trình Krebs đã nối với chu trình ornithine.

Những enzyme của chu trình ornithine phần thì định vị trong cơ chất của ty thể đó là glutamate dehydrogenase và citrullinsynthetase, những enzyme còn lại của chu trình định vị trong tế bào chất.

Trong thực vật bậc cao cũng có các enzyme của chu trình ornithine. Trong hạt nảy mầm arginase và ornithin-transcarbamylase được tìm thấy. Trong đó enzyme cuối cùng xúc tác cho phản ứng tổng hợp citrulline từ carbamylphosphate và ornithine. Vì vậy người ta cho rằng, những enzyme kể trên có vai trò quan trọng đối với việc huy động các protein dự trữ. Trong cây nho arginine là một dạng dự trữ nitơ, được tích luỹ vào mùa thu ở trong cành (gỗ).

Trong nhiều trường hợp urê được tách thành CO2 và NH3 trong đất nhờ urease, như vậy nitơ được bón ở dạng urê được tiếp nhận ở dạng NH4+ hoặc sau đó được biến đổi nhờ vi sinh vật sang dạng NO3- .

Sự biến đổi NH3 trong đất thành NO3- được thực hiện nhờ vi khuẩn, chúng oxy hoá (đốt cháy) NH3 cũng như HNO2 để thu được năng lượng cho quá trình trao đổi chất. Những loài vi khuẩn quan trọng nhất oxy hoá NH3 là loài nitrosomonas, nitrosocystus, nitrospira. Sự oxy hoá cần có O2 tương ứng theo phương trình sau:

NH3 + 3/2 O2 => HNO2 + H2O

Sự oxy hoá HNO2 thực hiện nhờ loài nitrobacter và tương ứng với phương trình sau:

HNO2 + 1/2 O2 => HNO3

Ở quá trình này một acid mạnh, HNO3 được tạo thành. Đó là nguyên nhân thực tế sự phân giải các chất hữu cơ chứa nitơ làm cho đất chua. Quá trình tạo nitrite (HNO2-) và nitrate trong đất được gọi là quá trình nitrate hoá. Những loài vi khuẩn cần cho quá trình này có nhiều trong đất. Đất trồng thông thoáng với độ pH trung tính là điều kiện lý tưởng đối với những vi khuẩn này.

Trong điều kiện yếm khí có thể xảy ra sự khử NO3- (khử nitrate hô hấp hoặc là dị hoá). Quá trình này được gọi là phản nitrate hoá. Ngày nay người ta biết 23 loài khác nhau có khả năng này. Đó là Alcaligenes, Agrobacterium, Azospirillum, Holobacterium, Pseudomonas và Rhizobium. Chúng có khả năng tạo ra những enzyme khử trong điều kiện thiếu O2, sử dụng O trong NO3- cho hô hấp háo khí, là chất nhận e- của chuỗi hô hấp. Ở quá trình này NO3- bị khử thành N2O và N2. Trong quá trình phản nitrate hoá cũng xuất hiện NO. Trình tự phản ứng được giải thích như sau:

Ở quá trình này có 4 enzym khử tham gia: NO3- -Reductase, NO2-Reductase, NO-Reductase và N2O-Reductase. Enzyme quan trọng nhất là NO2--Reductase, xúc tác cho quá trình chuyển ion NO2- thành dạng chất khí (NO). N2O-Reductase không có trong tất cả vi khuẩn phản nitrate hoá. Ở một số vi khuẩn quá trình này kết thúc với chuỗi phản ứng ở N2O. Từ quá trình phản ứng rút ra rằng, sự phản nitrate hoá tạo tính kiềm, vì chúng cần H+ ở mỗi bước của phản ứng. Sự phản nitrate hoá có một vai trò lớn trong tự nhiên. Từ hợp chất nitơ vô cơ và hữu cơ N2 được giải phóng lại đi vào không khí. Sự phản nitrate hoá đối lập với sự đồng hoá N2. Trong đó quá trình đầu tiên sản sinh N2, quá trình thứ hai cần N2. Nhờ vi khuẩn cố định đạm mà hằng năm từ 100-200 x 106 t N từ không khí được đưa vào đất. Bằng quá trình phản nitrate hoá mà hằng năm có khoảng 200-300 x 106 t N ở dạng N2 được giải phóng ra trong không khí. N2O được tạo ra trong quá trình phản nitrate hoá là vấn đề sinh thái khó khăn. Đó là chất rất bền vững, bay lên đến tầng tĩnh khí và ở đó tham gia vào sự phân giải tầng ozon.