1. Khái niệm như thế nào là nuôi cấy mô tế bào thực vật. Tại sao

 Định nghĩa nuôi cấy mô tế bào thực vật:

- Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.

- Nuôi cấy mô, tế bào thực vật còn gọi là là nuôi cấy thực vật invitro (trong ống nghiệm) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài đồng ruộng, gọi là nuôi cấy invivo.

- Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm hàng loạt các kỹ thuật khác nhau có khả năng ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều các lĩnh vực:

 Các kỹ thuật của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng của chúng.

Kỹ thuật Ứng dụng

Nuôi cấy hạt giống

(Seed culuture)  Tăng khả năng nảy mầm của các hạt khó nảy mầm trong điều kiện bình thường

 Thúc đẩy quá trình nảy mầm bằng cách bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng

 Tạo ra cây con dùng cho nuôi cấy meristem hoặc các bộ phận khác.

Hoa cái

(Bầu quả, noãn)  Thụ phấn trong ống nghiệm phục vụ lai xa

 Tạo đơn bội

 Tạo đa phôi

Hoa đực

(Bao phấn, hạt phấn)  Tạo mô sẹo và cây đơn bội

 Tạo đột biến ở mức đơn bội

 Tạo dòng đồng hợp tử

Phôi hợp tử  Nuôi cấy cứu phôi khi lai xa

 Nhân các dòng lai xa

 Phá ngủ nghỉ của hạt

Mô sẹo  Tạo phôi vô tính

 Nuôi cấy tế bào đơn và tách tế bào trần

 Tạo cây có biến dị soma

Tế bào  Tạo đột biến ở mức độ tế bào

 Tạo tế bào trần để lai vô tính

 Biến nạp gen

 Nuôi cấy tế bào đơn

Đỉnh chồi

(Đỉnh sinh trưởng)  Tạo và nhân nhanh các dòng đồng nhất về di truyền

 Làm sạch virus

 Nghiên cứu sinh lý phát triển

Phân hóa phôi vô tính

(Somatic embryogenesis)  Làm đường hướng tái sinh chủ yếu ứng dụng:

- Nhân nhanh

- Sản xuất nhân tạo

 Cung cấp vật liệu để tạo các protoplast các khả năng sinh phôi

 Cho phép cơ khí hóa quá trình nuôi cấy và ứng dụng bioreactor

Đột biến soma  Phân lập các biến dị có ích ở kiểu hình lý tưởng song còn thiếu một số tính trạng mong muốn

 Phân lập các biến dị có ích để sản xuất các hợp chất sơ cấp và thứ cấp

 Phân lập các biến dị có ích với khả năng kháng bệnh, chống chịu stress tốt hơn

 Tạo các biến dị di truyền không qua lai hữu tính ở những dòng ưu tú

2. Sự biểu hiện tính toàn năng của tế bào thực vật trong nuôi cấy invitro diễn ra như thế nào?

 Khái niệm về tính toàn năng của tế bào thực vật:

- Haberlandt (1902) lần đầu tiên quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiền tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh

- Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào.

 Sự biểu hiện tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy invitro

- Quá trình từ nguồn vật liệu ban đầu là tế bào hoặc mô thực vật nuôi cấy phân hóa thành cây hoàn chỉnh được gọi là sự biểu hiện về tính toàn năng của tế bào thực vật.

- Khả năng biểu hiện tính toàn năng của các tế bào, mô của cơ thể là khác nhau.

- Tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy invitro biểu hiện qua ba giai đoạn:

 Tế bào phản phân hóa với sự phát sinh tế bào khả biến

 Sự định hướng phân hóa tế bào (hoặc tác dụng quyết định của tế bào).

 Sự phát sinh hình thái và phát triển cơ quan

1. Sự phản phân hóa tế bào và sự hình thành tế bào khả biến

- Sự phản phân hóa tế bào là quá trình mà tế bào đã phân hóa trong một điều kiện nhất định, khôi phục khả năng phân chia, chuyển thành tế bào phân sinh và hình thành mô sẹo.

- Trong đó, có một bộ phận hình thành tế bào cảm ứng phát sinh hình thái, tức là tế bào có thể cảm thụ tín hiệu kích thích phân tử, từ đó xác định đường hướng mới của sự sinh trưởng và phát triển tế bào

 Chu kỳ tế bào với sự phản phân hóa: tế bào trưởng thành phản phân hóa thành ra tế bào mô phân sinh, bước vào chu kỳ tế bào ở thời kỳ G1 hoặc thời kỳ G2. Điều này được quyết định bởi khả năng phân hóa và trạng thái sinh lý ban đầu của nó.

 Điều kiện và đặc trưng của sự phản phân hóa tế bào

- Có rất nhiều nhân tố ảnh hưởng tới sự phân hóa của tế bào và mô tách rời, trong đó nhân tố chủ yếu là chất điều tiết sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin và cytokinin. Tế bào và mô thực vật khác nhau thì điều kiện phản phânhóa của chúng là không giống nhau.

- Trong quá trình phản phânhóa tế bào thực vật, cách phân bào, biểu hiện gen và sự chuyển hóa vật chất trong tế bào đều có đặc trưng rõ rệt: sự hòa nhập của hạch nhân và nhân, sự dung giải màng nhân, sự phân bào có tơ tạo tế bào đa nhân, sự biểu hiện của các kiểu gen đặc trưng.

 Tế bào cảm biến:

- Tế bào cảm biến là chỉ trạng thái của tế bào được hình thành sau giai đoạn nuôi cấy khởi động và có khả năng cảm thụ tác nhân kích thích để phát sinh hình thái.

- Thời gian và điều kiện mà tế bào thực vật biến đổi về mặt hình thái để tạo thành tế bào cảm biến có sự sai khác tương đối lớn: có trước khi tế bào diễn ra phản phân hóa nhưng cũng có thể trong hoặc sau thời kỳ tế bào phản phân hóa

- Tế bào cảm biến có đặc trưng về cấu trúc và sự biểu hiện gen. ví dụ các tế bào huyền phù của cà rốt.

- Ví dụ: ở 5 kiểu gen mía có xuất hiện 63 loại protein chuyên phản phân hóa, trong đó có 33 loại protein xuất hiện trong tất cả các kiểu gen, trong protein chuyên phản phân hóa thì có 3 loại đặc hiệu cho sự phát sinh hình thái và cảm ứng tạo mô sẹo và có 1 protein không có chức năng này.

- Phát hiện sự cảm thụ hình thái phôi tế bào thực vật với gen enzyme thụ thể phát sinh phôi soma (somatic embryogenesis receptor kinase - SERK) có quan hệ với nhau, biểu hiện này được coi là dấu hiệu của tế bào thể phôi. Trong cà rốt, SERK chỉ có trong tế bào thể phôi và biểu hiện ở thời kỳ đầu phát triển tế bào thể phôi, sau thời gian phôi hình cầu thì ngừng biểu hiện.

2. Tác dụng quyết định của tế bào thực vật

 Sự "quyết định" (determination) của tế bào là sự định hướng phân hóa và trình tự phát triển của tế bào:

 Trong quá trình nuôi cấy mô, sự quyết định này biểu hiện ở 2 mặt:

- Sự định hướng sẵn có của tế bào mẫu cấy

- Cảm ứng sự định hướng của tế bào nuôi cấy

 Đặc trưng của tế bào quyết định

- Biến đổi quá trình trao đổi chất

- Biến đổi hình thái và cấu trúc tế bào, đặc biệt là màng tế bào

- Các tế bào khác nhau có thời gian hoàn thành tác dụng quyết định không giống nhau

- Ví dụ: biến đổi tế bào của mô lá sơn trà khi hình thành phôi soma.

 Tín hiệu phân tử của sự quyết định tế bào

 Sự quyết định của tế bào là kết quả tác dụng của tín hiệu phân tử giữa tế bào với tế bào.

 Trong một cá thể thực vật hoàn chỉnh, sự sinh trưởng phát triển của mỗi tế bào, mô hoặc cơ quan đều bị sự điều tiết bởi tín hiệu phân tử của tế bào, mô và các cơ quan khác bên cạnh để duy trì sự sinh trưởng phát triển bình thường của cây.

 Trong điều kiện nuôi cấy invitro, tế bào cũng biểu hiện sự điều tiết tín hiệu phân tử hoặc tác dụng truyền tin của nó.

 Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh đều nêu trên. Ví dụ:

- Tế bào biểu bì thuốc lá khi nuôi cấy đơn độc thì mẫu cấy chỉ có thể trương to, không phân hóa cơ quan, nếu đưa tế bào biểu bì về vị trí cũ trong đoạn thân thì lập tức bị kích thích để hình thành chồi.

- Đã phát hiện ra vai trò phân tử tín hiệu quyết định phát sinh phôi của arabinogalactan protein (AGP) và chito-oligosaccharide ở màng tế bào của các cây cà rốt, cải dầu, sam vân (thông Nauy)...

3. Sự phân hóa tế bào và mô

 Tế bào đã trải qua cảm ứng quyết định, trong điều kiện nhất định thì có thể phân hóa thành mô, cơ quan và cây khác nhau, quá trình này gọi là sự tái phân hóa. Sự phân hóa tế bào và mô là bước thứ nhất của sự phát sinh cơ quan và phôi.

 Nghiên cứu sự phân hóa mạch dẫn được cọi là mô hình nghiên cứu sự phân hóa tế bào trong nuôi cấy mô thực vật.

 Sự phân hóa mô là cơ sở của phát sinh hình thái, khác biệt cơ bản trong quá trình phát sinh hình thái thể hiện ở sự phân cực của tế bào.

3. Điều kiện và đặc trưng của mỗi một giai đoạn biểu hiện tính toàn năng của tế bào thực vật trong nuôi cấy invitro?

4. Thế nào là sự suy thoái tính toàn năng của tế bào thực vật trong nuôi cấy invitro. Nguyên nhân của hiện tượng suy thoái này.

 Trong nuôi cấy invitro tính toàn năng của tế bào có thể bị suy thoái và biến mất. Điều này thường biểu hiện dưới dạng:

- Sự thích ứng của mô sẹo: hiện tượng những mô nuôi cấy lúc đầu phải phụ thuộc vào một loại chất kích thích sinh trưởng nào đó mới có khả năng tự dưỡng chất đó

- Sự suy thoái tiềm năng phát sinh hình thái mẫu cấy khi nuôi cấy trong thời gian dài: sự tăng lên của số lần cấy chuyển, tiềm năng phát sinh hình thái của mẫu mô nuôi cấy thực vật giảm đi hoặc bị mất, thậm chí sự phân chia và sinh trưởng tế bào giảm dẫn đến chỗ ngừng hẳn.

 Giả thuyết về nguyên nhân dẫn đến sự suy thoái tiềm năng phát sinh hình thái mẫu nuôi cấy:

- Giả thuyết di truyền: do sự thay đổi trong độ bội của tế bào mẫu nuôi cấy, xuất hiện thể không chỉnh bội, cấu trúc nhiễm sắc thể biến đổi và đột biến gen...dẫn đến suy thoái tính tiềm năng phát sinh hình thái.

- Giả thuyết sinh lý: cho răng sự biến đổi mức độ và sự cần bằng chất kích thích sinh trưởng nội sinh là nhân tố của sự suy thoái tiềm năng phát sinh hình thái.

- Giả thuyết cạnh tranh: trong mô sẹo hoặc tế bào nuôi cấy, có sự kế tiếp và luân phiên sinh trưởng của các loại tế bào với khả năng phát sinh hình thái khác nhau. Qua quá trình nuôi cấy lâu dài, các tế bào không có tiềm năng phát sinh sẽ chiếm ưu thế hơn.

5. Tác dụng của các thành phần môi trường đến quá trình sinh trưởng phát sinh hình thái của tế bào (vai trò của môi trường nuôi cấy)?

 Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hóa tế bào và cơ quan trong nuôi cấy. Có nhiều loại môi trường nuôi cấy cho các loại thực vật khác nhau và mục đihcs nuôi cấy khác nhau. Môi trường thường bao gồm các thành phần chính sau đây:

- Nguyên tố đa lượng

- Nguyên tố vi lượng

- Nguồn cácbon hữu cơ

- Các vitamin

- Chất điều tiết sinh trưởng

- Chất làm đông môi trường

 Các nguyên tố đa lượng

- Các nguyên tố khoáng chất mà thực vật cần thiết khi nồng độ lớn hơn 0.5 mM/l gọi là nguyên tố đa lượng

- Các nguyên tố: N, P, K, S, Mg, Ca là cần thiết và thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy. Nói chung, nồng độ mỗi nguyên tố nói trên trong môi trường lớn hơn 30ppm. Chúng là nguyên liệu để tế bào xây dựng nên thành phần cấu trúc của mình.

 Các nguyên tố vi lượng

- Các nguyên tố khoáng mà thực vật cần thiết có nồng độ nhỏ hơn 0.5 mM/l gọi là nguyên tố vi lượng

- Fe, Cu, Zn, Mo, Bo, I, Co là các nguyên tố vi lượng thường được dùng trong môi trường nuôi cấy invitro. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzyme. Chúng được dùng với nồng độ mỗi nguyên tố nhỏ hơn 30ppm và tùy thuộc vào loại môi trường mà hàm lượng và tỷ lệ của chúng sẽ thay đổi.

- Trong môi trường nuôi cấy, Fe thường được dùng dưới dạng muối phức chelat Fe-EDTA, Fe-citrate.

 Nguồn cácbon hữu cơ:

- Khi nuôi cấy initro tế bào, mô thực vật sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng. Vì vậy, cần nguồn cacbon hữu cơ và thường dùng là đường saccaroza với liều lượng 20-30 g/l. Trong một số trường hợp đặc biệt, có thể sử dụng nguồn đường khác như glucoza, maltoza, galactoza và lactoza.

 Các vitamin

- Mô, tế bào nuôi cấy invitro có thể tự tổng hợp vitamin nhưng không đủ cho hoạt động sống của chúng nên cần bổ sung thêm vitamin vào môi trường nuôi cấy.

- Đáng chú ý là vitamin: thiamin, axit nicotinic, pyridoxin và riboflavin. Nồng độ thường dùng khoảng 1mg/l. Các vitamin này đóng vai trò quan trọng trong tế bào vì chúng là coenzyme của các enzyme.

- Myo-inositol cần được bổ sung vào một lượng khá lớn 50-100mg/l, chất này tỏ ra có tác dụng khá rõ đến sự phân chia của tế bào.

 Các chất điều tiết sinh trưởng

- Các chất điều tiết sinh trưởng là yếu tố quan trọng nhất trong môi trường quyết định đến kết quả nuôi cấy.

- Auxin và cytokinin được sử dụng nhiều hơn cả trong nuôi cấy invitro

- Auxin kích thích sự hình thành mô sẹo, tạo rễ bất định và kích thích sự dãn của tế bào. Các auxin thường sử dụng là: 2,4 D, -NAA (-naphtylaxetic acid), IAA. Nồng độ sử dụng là 10-5-10-7M.

- Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hóa chồi. Các cytokinin thường được sử dụng là BA (benzyl adenin), kinetin, 2 isopentenyladenin và zeatin (một cytokinin tự nhiên). Nồng độ sử dụng là 10-5-10-7M.

- Tỷ lệ auxin/cytokinin quyết định sự phân hóa của mẫu cấy theo hướng tạo rễ, chồi hay mô sẹo.

 Các hỗn hợp hợp chất tự nhiên

- Là thành phần thường được sử dụng nhưng không phải là thành phần bắt buộc. Chúng làm gia tăng thành phần dinh dưỡng và chất có hoạt tính sinh học cho môi trường nên kích thích sự sinh trưởng và phân hóa của mẫu cấy. Thường bao gồm:

- Nước dừa: thường chứa các axit amin, axit hữu cơ, đường, ARN, ADN. Đặc biệt trong nước dừa có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy invitro đó là: myo-inositol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các glucosit của cytokinin.

- Dịch nghiền của một số rau, quả tươi (khoai tây, cà rốt, chuối, táo...) thành phần hóa học có đường, axit nucleic, axit amin, vitamin, khoáng...

- Dịch thủy phân casein (casein hydrolysat) hay pepton chủ yếu được sử dụng làm nguồn bổ sung axit amin.

 Chất làm đông cứng môi trường - agar

- Agar là một loại polysaccarit của tảo. Ở 800C thạch ngậm nước chuyển sang trạng thái sol còn ở 400C thì trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nước của thạch khá cao 6-12 g/l nước. Thạch ở trạng thái gel nhưng vẫn để cho các ion vận chuyển dễ dàng và có độ thoáng khí cao. Nồng độ trung bình 6-8 g/l

 Độ pH của môi trường

- Độ pH của môi trường nuôi cấy thích hợp cho đa số loại cây dao động từ 5,5-6,0

- Trường hợp pH thấp thạch có thể không đông sau khi khử trùng môi trường, pH cao làm cứng môi trường.

- Khi pH

6. Ảnh hưởng của các nhân tố vật lý?

 Ảnh hưởng của ánh sáng

- Quá trình nuôi cấy mô tế bào diễn ra dưới ánh sáng nhân tạo trong buồng nuôi có nhiệt độ được kiểm soát.

- Nguồn ánh sáng sử dụng là đèn huỳnh quang. Thông thường trên giá đặt bình nuôi cấy, khoảng cách từ đèn cho đến nắp bình nuôi cấy là 45-50 cm, đảm bỏa sự khuếch tán ánh sáng được đều khắp.

- Ánh sáng trong bình và ngoài bình khác nhau rất nhiều và sự phân bố ánh sáng trong bình phụ thuộc vào diện tích nắp bình, loại bình và sự sắp xếp bình trên giá đặt bình nuôi.

- Thông thường cường độ ánh sáng trong buồi nuôi thấp hơn 10 lần so với ánh sáng tự nhiên ban ngày, dao động trong khoảng 40-140 mmol/m2/s (tương đương với 3000-10000 lux). Việc sử dụng cường độ chiếu sáng thấp trong nuôi cấy invitro nhằm tiết kiệm chi phí năng lượng, giảm hiệu ứng nhà kính và do mẫu cấy chủ yếu sống theo phương thức dị dưỡng.

- Tỷ lệ quang tử của vùng ánh sáng màu đỏ/gần đỏ/và xanh/đỏ ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái. Sự phát sinh hình thái xảy ra khi ánh sáng có bước sóng thuộc ánh sáng màu xanh (400-460 mm), màu đỏ (620-680 mm), gần màu đỏ (700-800 mm) và màu tím (300-400 mm)

- Quang chu kỳ trong buồng nuôi thường được duy trì ở chế độ 16 giờ chiếu sáng trên ngày.

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

- Nhiệt độ trong bình nuôi thường cao hơn nhiệt độ ngoài bình một vài độ và phần đáy thường sẽ ấm hơn so với nắp bình.

- Nhiệt độ trung bình của buồng nuôi cho nhiều loại cây thường là 250C (dao động từ 17-300C). Các cây nhiệt đới cần có nhiệt độ trung bình của buồng ở mức cao hơn 27,70C (dao động 24-320C)

- Sự chênh lệch nhiệt độ giữa ban ngày (khi chiếu sáng) và ban đêm (khi không có chiếu sáng) thường được duy trì từ 4-80C. Ví dụ nhiệt độ ban ngày là 280C ban đêm là 200C hay nhiệt độ ban ngày là 280C nhiệt độ ban đêm là 240C...sự chênh lệch nhiệt độ như vậy hỗ trợ sự trao đổi khí của bình nuôi và cải thiện sự sinh trưởng của cây nuôi cấy.

- Với mỗi loại cây khác nhau có khoảng nhiệt độ thích hợp riêng. Ví dụ cây khoai tây sinh trưởng rất nhanh ở nhiệt độ ngày đêm là 220C/180C, khi nhiệt độ ngày đêm là 270C/220C cây sinh trưởng chậm hẳn.

- Tốc độ sinh trưởng của mẫu cấy thường giảm hẳn dần khi nhiệt độ buồng nuôi thấp hơn nhiệt độ tối thích nhưng giảm xuống rất nhanh khi nhiệt độ buồng nuôi cao hơn nhiệt độ tối thích.

 Nồng độ khí CO2

- Nồng độ khí CO2 trong bình nuôi cấy các cây có diệp lục thường giảm thấp hơn điểm bù CO2 (50-100 mmol/mol) trong hầu hết các chế độ quang chu kỳ.

- Nồng độ CO2 gia tăng trong giai đoạn tối (510 mmol/mol) nhưng giảm sau thời gian được chiếu sáng (100mmol/mol) trong vài giờ, khi được đưa lại và trong tối thì nồng độ CO¬¬¬2 lại gia tăng trở lại. Ngay cả trong trường hợp thay nắp đậy có khả năng trao đổi khí, nồng độ CO2 giảm xuống còn 100-200 mmol/mol trong thời gian có chiếu sáng do đó cây invitro sống dị dưỡng (Kozai & Seikimoto, 1988).

7. Trình bày các đường hướng phát sinh hình thái của mô tế bào thực vật khi nuôi cấy? Đặc trưng của các đường hướng này là gì? Anh (chị) có suy nghĩa gì về vai trò của mô sẹo trong nuôi cấy mô tế bào thực vật?

 Sự cảm ứng và điều tiết sinh trưởng của mô sẹo

 Sự cảm ứng mô sẹo

- Mô sẹo là các tế bào vách mỏng, không chuyên hóa được tạo thành do sự phản phân hóa của tế bào nuôi cấy, trải qua thờiky phân chia tế bào hình thành một khối tế bào sinh trưởng vô tổ chức.

- Sự hình thành mô sẹo có thể chia ra làm ba thời kỳ:

 Thời kỳ cảm ứng: các tế bào chuyên hóa của mẫu cấy chuyển ngược trạng thái phát triển, biến đổi hình thái chức năng theo hướng tế bào phân sinh.

 Thời kỳ phân chia tế bào: các tế bào không phân hóa của mô sẹo có tần suất phân chia tương đối nhanh.

 Thời kỳ phân hóa tế bào: tốc độ phân chia và sinh trưởng tế bào giảm đi cho tới khi ngừng hẳn, trong mô sẹo xuất hiện cấu trúc mô dẫn.

- Tác nhân chủ yếu gây cảm ứng mô sẹo là chất điều tiết sinh trưởng

- Không phải tất cả thực vật đều cảm ứng mô sẹo bởi các chất kích thích sinh trưởng. Tùy thuộc vào chủng loại mẫu cấy mà có sự khác biệt về loại và hàm lượng chất điều tiết sinh trưởng

- Ví dụ: cảm ứng mô sẹo của cây thuộc họ hòa thảo cần auxin, đặc biệt là 2,4 D nhưng đoạn thân và lá mầm của đào thì có thể cảm ứng mô sẹo khi môi trường nuôi cấy có chứa zeatin

- Tùy mục đích nghiên cứu thực nghiệm mà chọn lọc loại và hàm lượng chất điều tiết sinh trưởng thực vật khi cảm ứng mô sẹo

- Ví dụ: tạo mô sẹo để sản xuất sinh khối tế bào, hay sản xuất hợp chất thứ cấp, trong môi trường nuôi cấy nên sử dụng chất auxin là chính, nhưng khi cảm ứng mô sẹo để tái sinh chồi bất định nên sử dụng phối hợp auxin và cytokinin

 Điều tiết sự sinh trưởng của mô sẹo

- Đặc trưng hình thái và sinh trưởng của mô sẹo là kết quả tác dụng tương hỗ giữa các nhân tố: mẫu thực vật nuôi cấy, thành phần môi trường nuôi dưỡng, điều kiện nuôi cấy cũng có thể thể hiện phương hướng sinh trưởng phát triển sau khi tế bào cảm ứng "quyết định"

- Nói chung, mô sẹo sinh trưởng khỏe mạnh là những mô thể hiện màu vàng sữa hoặc màu trắng có độ sáng bóng, cũng có mô thể hiện màu lục nhạt hoặc màu lục: mô sẹo lão hóa chuyển thành màu vàng hoặc màu nâu.

- Mô sẹo có màu lục, lục nhạt thì tiềm năng phát sinh cơ quan mạnh, các mô sẹo màu vàng nhạt hoặc màu sữa, xốp giòn có tiềm năng phân hóa tế bào thể phôi, các mô sẹo màu trắng hoặc màu xám có khả năng tái sinh.

- Điều tiết hình thái và sinh trưởng mô sẹo thông qua thành phần môi trường nuooi cấy, đặc biệt là chất điều tiết sinh trưởng thực vật. Căn cứ vào yêu cầu thực nghiệm và kinh nghiệm để cải biến thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy mà tiến hành điều tiết mô sẹo.

- Ví dụ: trong môi trường N6 dùng 2,4 D (1-10 mg/l) rất thích hợp cảm ứng mô sẹo của những cây thuộc họ hòa thảo, đồng thời phần lớn mô sẹo của chúng có hình dạng hạt mềm, phân tán, có tiềm năng phát sinh thành phôi và cơ quan. Nhưng đối với các loại cây nói trên nếu sử dụng NAA, IAA, IBA thì có tác dụng cảm ứng tương đối yếu, mô sẹo thu được phần lớn có dạng cụm, cứng, rắn.

1.2 Sự phát sinh cơ quan

 Là quá trình tế bào nuôi cấy cảm ứng trong điều kiện nuôi dưỡng thích hợp tạo ra cơ quan là chồi bất định (adventitious bud) và rễ bất định (adventitious root)... từ đó hình thành nên cây hoàn chỉnh.

1.2.1 Đặc trưng của sự phát sinh cơ quan

 Sự phát sinh hình thái tái sinh cây, có thể tổng hợp gồm 5 phương thức cơ bản:

- Trước hết là hình thái rễ, trên rễ hình thành chồi, chẳng hạn nuôi cấy huyền phù tế bào cà.

- Trước hết hình thành chồi, sau đó hình thành rễ từ chồi, như sự tái sinh của đại đa số mô thực vật nuôi cấy.

- Trong mô sẹo sản sinh ra chồi và rễ, cấu trúc liên tiếp thành một trục thấp ví dụ như cà rốt.

- Hình thành thể dinh dưỡng khác như thân củ, thân vẩy và hình thành hình cầu, ví dụ tạo củ lily, lay ơn, protocorm hoa lan.

- Hình thành chồi hoa hoặc một bộ phận cơ quan sinh sản, như khi nuôi cấy tế bào trụ phôi cây phong lan thì tế bào nuôi cấy có thể phân hóa thành hạt phấn và noãn...

- Hai đường hướng phân hóa cơ quan của tế bào nuôi cấy:

 Phân hóa gián tiếp: mẫu cấy trước hết hình thành từ cụm mô sẹo, từ mô sẹo phát sinh ra mô tương tự như mô phân sinh, phân hóa hình thành trung tâm phân sinh. Đặc điểm của nó là tế bào nhỏ, đường kính tương đương nhau, màng mỏng, nhân lớn, bắt màu đậm. Từ trung tâm phân sinh sau đó hình thành cơ quan chồi rễ.

 Phân hóa trực tiếp: không có giai đoạn tạo mô sẹo rõ rệt, từ mẫu cấy trực tiếp hình thành trung tâm phân sinh có thể có nguồn gốc từ một tế bào hoặc nhiều tế bào. Các tế bào này bắt đầu phân chia, hình thành nên 2-3 tế bào ở gần nhau và tạo thành trung tâm phân chia liên tục với tốc độ nhanh. Tế bào xung quanh chúng cũng phân chia những với tốc độ chậm hơn. Từ trung tâm phân sinh hình thành cơ quan chồi, rễ.

1.2.2 Sự biến đổi sinh lý của tế bào nuôi cấy trong quá trình phát sinh cơ quan.

 Sự biến đổi axit nucleic và protein

 Tổng hợp protein đặc trưng là sự tất yếu của quá trình phát sinh cơ quan.

 Ví dụ: nuôi cấy lá mầm cây sam hoa cho thấy sự phát sinh của chồi có mối quan hệ với các protein có khối lượng phân tử 1600-20000U. Nhưng khi hình thành mô sẹo thì xuất hiện các protein có khối lượng phân tử từ 60000-65000U.

 Những nghiên cứu này là cơ sở để hiểu được sự tồn tại các gen mang tính tiêu biểu cho sự phát sinh cơ quan.

 Sự biến đổi hô hấp và các chất hydracabon

 Khi quan sát sự phân hóa trục phôi rau cải xanh thành rễ và chồi nhận thấy có sự thay đổi về tích lũy tinh bột: tinh bột tích lũy không ngừng, enzyme tổng hợp tinh bột không ngừng tăng lên, nhưng đồng thời hoạt tính của enzyme thủy phân tinh bột và emzyme phosphoryl hóa tinh bột cũng không ngừng tăng lên.

 Điều đó nói lên rằng, một phần tinh bột rất có thể là nguồn cung cấp năng lượng cần thiết cho sự phân hóa rễ và chồi.

 Sử dụng phương pháp đánh dấu C14 cho thấy: mô hình thành chồi so với các mô không hình thành chồi có quá trình hô hấp mạnh, hoạt tính loại enzyme của hai quá trình hô hấp và sự phân giải trao đổi đường glucose đều cao hơn.

 Tỷ lệ NADPH/NADP+ trong mô hình thành chồi giảm đến dưới 0.05 nhưng ở mô không hình thành chồi thì tỷ lệ này được giảm ổn định.

 Sự biến đổi cân bằng phytohormon

 Khi hình thành chồi yêu cầu về auxin ở mức độ thấp, nhưng khi hình thành hoa yêu cầu về auxin còn ở mức độ thấp hơn.

 Đặc trưng về nhu cầu auxin của sự hình thành rễ có hai thời kỳ: thời kỳ đầu khi hình thành mầm rễ yêu cầu auxin ở mức độ cao, thời kỳ sau khi kéo dài rễ yêu cầu auxin ở mức độ thấp.

 Sự biến đổi hàm lượng chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh của mẫu nuôi cấy có quan hệ với trạng thái chất kích thích nội sinh của mẫu nuôi cấy.

 Biến đổi của axit amin

 Khi hình thành chồi, mô có hàm lượng nước tương đối lớn, axit malic tăng lên, hàm lượng proline cao, có tỷ lệ treosine/serine cao.

 Dùng nguyên tố cacbon C14 đánh dấu axit sikimic và bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho thấy trong mô hình thành chồi so với mô không hình thành chồi thì C14 có nhiều trong tyrosine hơn là trong tryptophan và phenylalanine, bởi vậy các axit amin có vòng thơm có mối quan hệ với sự hình thành chồi.

1.2.3 Sự cảm ứng gen đặc hiệu khi phát sinh cơ quan

 Gen đặc hiệu quyết định sự phát sinh rễ bất định: sự biểu hiện gen đối với cảm ứng tạo rễ bất định đã được chứng minh. Ví dụ:

 Khi cảm ứng rễ trụ phôi cây tùng, trong họ gen cảm ứng sớm auxin (early auxin induced genes) có 5 gen LPEA từ 1-5 được biểu hiện rõ. Sau khi xử lý NAA trong 10 phút, LPEA2 và LPEA3 biểu hiện nhanh chóng, LPEA1 và LPEA4 thì sau 1 giờ mới biểu hiện nhưng LPEA5 sau khi xử lý 5 giờ mới biểu hiện, và sau 24 giờ đều đạt đến đỉnh cao và sự biểu hiện của chúng kéo dài trong 5 ngày.

 Nghiên cứu thể đột biến RAC của cây thuốc lá cho thấy gen HRGP nt3 biểu hiện tính đặc thù trong thời kỳ cảm ứng rễ bất định. Promoter của HRGP nt3 ở thể đột biến không bị hoạt hóa bởi auxin nên xử lý auxin ở nồng độ bất kỳ nào đều không cảm ứng phát sinh rễ.

 Gen đặc hiệu quyết định phát sinh chồi bất định

 Phát sinh chồi bất định trước tiên là cảm ứng mô sẹo hình thành mô phân sinh đỉnh chồi (shoot apical meristem - SAM) sau đó mô phân sinh đỉnh chồi phân hóa ra lá nguyên thủy và chồi nách. Sự hình thành SAM được điều khiển bởi gen đặc hiệu. Ví dụ:

- Phát hiện ra gen PkMADS1 (Paulownia kawakanii MADS1) ở cây paulownia liên quan chặt chẽ đến sự hình thành chồi bất định. Khi cảm ứng tạo mô sẹo, gen này không biểu hiện. Nó chỉ biểu hiện khi cảm ứng tạo chồi. Ngay trong điều kiện tự nhiên, gen PkMADS1 chỉ biểu hiện ở đỉnh chồi mà không biểu hiện ở đỉnh rễ, lá khởi nguyên hay chồi hoa.

- Phát hiện gen ESR1 (enhance of shoot regeneration) ở cây Arabidopsis. Gen này hoạt hóa bởi cytokinin và gây phát sinh chồi từ mô rễ nuôi cấy trên môi trường có cytokinin.

1.3 Sự phát sinh phôi soma. (sự cảm ứng tế bào soma hình thành phôi hoàn chỉnh)

1.3.1 Đặc trưng hình thành phôi soma

1.3.1.1 Hình thái và giải phẫu

 Sự hình thành, phát triển phôi soma và phôi hợp tử giống nhau ở chỗ cần phải trải qua thời kỳ hình cầu, thời kỳ hình tim, thời kỳ ngư lôi và thời kỳ hình thành lá mầm. Phôi soma có cấu trúc hình thái tương tự như phôi hợp tử, cuối cùng nảy mầm thành cây con.

 Nhưng phôi soma khác với phôi hợp tử là: không có sự phân hóa nội nhũ, sự phát triển cuống phôi bị ức chế hoặc nó bị tiêu biến, nói chung phôi soma không có quá trình khô phôi và ngủ nghỉ.

 Có 3 điểm sai khác rõ rệt giữa phát triển phôi soma và sự phát triển chồi bất định

- Thể phôi có sự phân hóa thành 2 cực là mầm rễ và mầm chồi, nhưng bất định chỉ có kết cấu đơn cực là mầm chồi.

- Các bó mạch của thể phôi tách rời khỏi bó mạch của mẫu nuôi cấy nhưng ở chồi bất định bó mạch của nó liên kết với bó mạch của mẫu nuôi cấy.

- Tế bào thể phôi nảy mầm thành cây trong ống nghiệm, thông thường không cần giai đoạn cảm ứng sinh rễ, nhưng chồi bất định cần phải chuyển sang môi trường nuôi cấy cảm ứng rễ mới hình thành cây hoàn chỉnh

1.3.1.2 Con đường hình thành phôi soma

 Phát sinh trực tiếp: là thể phôi phát triển từ mẫu nuôi cấy.

 Mẫu nuôi cấy có thể là biểu bì, chu bì, tiền phôi hợp tử, tế bào nuôi cấy huyền phù và tế bào trần.

 Ví dụ: tế bào biểu bì thân Thạch long, biểu bì trù phôi hướng dương và tế bào phôi tâm cây cam quýt...có thể trực tiếp phát sinh phôi.

 Nói chung, phương thức phát sinh trực tiếp phôi soma là do tế bào trong mẫu nuôi cấy tồn tại tế bào tiền phôi (pre-embryogenic determin cells - PEDC) trong nuôi cấy thì tế bào này trực tiếp bước vào giai đoạn phát sinh phôi, hình thành thể phôi soma.

 Phát sinh gián tiếp: là thể phôi phát triển từ mô sẹo hoặc huyền phù tế bào. Thông qua phản phân hóa đồng thời do cảm ứng định hướng phát triển tạo tế bào quyết định cảm ứng phát sinh phôi (induced embryogenic determined cells, IEDC) và chúng phát triển hình thành phôi soma.

1.3.1.3 Quá trình hình thành phôi soma

 Sự cảm ứng và đặc trưng của tế bào phát sinh phôi

 Chất sinh trưởng là một nhân tố chủ yếu cảm ứng hình thành tế bào phát sinh phôi.

 Raemakers và cộng sự (1955) nghiên cứu sự phát sinh phôi soma phôi của 65 loài thực vật song tử diệp, trong đó có 17 loài không cần chất kích thích trong môi trường nuôi cấy, 29 loài thì cần môi trường nuôi cấy chứa auxin, 25 loài cần cho thêm cytokinin một cách thích hợp trong môi trường nuôi cấy.

 Tần suất sử dụng các chất auxin khác nhau là 2,4 D là 49%, NAA là 27%, IAA 6%, IBA 6%, picloram và Dicamba là 5%. Tần suất sử dụng chất cytokinin khác nhau là 6-BAP là 57%, kinetin 37%, zeatin và thidiazuron là 3%.

 Tế bào phát sinh phôi là các tế bào kích thước nhỏ, không có không bào, nhân lớn và nhiều hạch nhân, tế bào chất giàu mARN, protein và tinh bột hoạt tính enzyme khử hydro cao...

 Sự phát triển hình thái phôi soma.

 Các tế bào, cụm tế bào phát sinh phôi khi được chuyển sang môi trường nuôi cấy có nồng độ auxin thấp hoặc không có auxin thì sự phân chia của các tế bào chậm lại, cụm tế bào hình cầu phát triển thành phôi hình cầu.

 Trong quá trình phát triển phôi hình cầu bước thứ nhất là hình thành lớp biểu bì gốc, sau đó hình cầu sẽ tiếp tục phát triển thành phôi.

 Sự trao đổi chất, hoạt động sinh lý, sinh hóa của phôi trong thời kỳ hình cầu có rất nhiều gen đặc thù biểu hiện, có lẽ gần giống như sự phát triển của phôi hợp tử. Thời kỳ phôi hình cầu là thời kỳ then chốt của phân hóa đỉnh thân của phôi soma.

 Sự thành thục và nảy mầm của phôi soma.

 Chất lượng của phôi soma nói chung là kém, thường chỉ có từ 3-5% có thể sinh trưởng thành cây.

 Nguyên nhân chủ yếu là phôi soma không trải qua giai đoạn "phôi thành thục" giống như phôi hợp tử.

 Quá trình "phôi thành thục" là quá trình mà phôi tích lũy dinh dưỡng, dự trữ vật chất và protein chịu khô hạn, trong quá trình này kích thước của phôi không thay đổi.

 So sánh hàm lượng protein trong phôi hợp tử và phôi soma cọ dầu sau khi thụ phấn 14-17 tuần (thời kỳ cuối sinh trưởng phát triển phôi) cho thấy:

- Trong phôi hợp tử protein 7S (protein dự trữ) chiếm 10% khối lượng khô, protein hoàn tan là 50%

- Trong phôi soma protein 7S chỉ chiếm 0.3% khối lượng khô, chỉ có 4% là protein hòa tan, so với phôi hợp tử thì thấp hơn 80 lần, dẫn đến sự thành thục và nảy mầm tế bào phôi bị ức chế.

 Xử lý ABA, ẩm độ và cưỡng bức thẩm thấu...có thể xúc tiến sự thành thục phôi soma, nâng cao tỷ lệ nảy mầm. Ví dụ:

- Scnaratna và cộng sự (1989, 1990) sau khi sử dụng ABA xử lý phôi soma mục túc hoa tím từ thời kỳ ngư lôi đến thời kỳ song tử diệp, trong điều kiện ẩm độ 10-15% thì trên 60% phôi sống, nảy mầm thành cây con.

- Janick và cộng sự (1993) sử dụng 1mol/l ABA và 5 mmol/l L. Proline xử lý tế bào phôi rau cần, làm cho tỷ lệ sống từ 13% tăng lên đến 84%.

- Buccheim và cộng sự (1989) lấy tế bào phôi đậu tương đặt vào môi trường nuôi cấy 10% đường saccharose làm cho nó thành thục, tỷ lệ thành cây từ 50% tăng lên đến 96%.

 Một số nhân tố khác ảnh hưởng tới sự nảy mầm của phôi soma là sự ngủ nghỉ. Phôi soma của một số thực vật sau khi thành thục bước vào thời kỳ nghỉ, không thể trực tiếp nảy mầm.

 Có thể xử lý nhiệt độ thấp để khắc phục hiện tượng này. Ví dụ: phôi soma cây nho trong khoảng thời kỳ hình cầu đến thời kỳ tạo lá mầm xử lý 2 tuần ở nhiệt độ dưới 40C thì có thể vượt qua thời kỳ nghỉ.

8. Nhân giống vô tính là gì? Ưu thế và hạn chế của kỹ thuật này? Nên ứng dụng kỹ thuật nhân nhanh trong trường hợp nào. Vì sao? Các bước cụ thể của quá trình...Cho ví dụ minh họa. Các tồn tại của nhân giống invitro và cách khắc phục. Các công nghệ nhân giống cây trồng bằng quang tự dưỡng và bioreactor là gì. Khả năng ứng dụng.

 Nhân giống vô tính là quá trình sản xuất một lượng lớn cây hoàn chỉnh, từ các bộ phận, cơ quan như chồi, mắt ngủ, vảy củ, đoạn thân lá...của cây mẹ ban đầu thông qua kỹ thuật nuôi cấy invitro.

 Ưu thể của kỹ thuật nhân giống invitro

- Phương pháp có hệ số nhân rất cao và cho ra các cá thể tương đối đồng nhất về mặt di truyền

- Có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường).

- Chủ động kế hoạch sản xuất dễ dàng tạo được cây sạch virus

- Các cây sau nhân invitro có xu hướng được trẻ hóa nâng cao hiệu quả nhân bằng phương pháp thông thường sau đó.

 Hạn chế:

- Chi phí cao so với các phương pháp nhân giống vô tính khác nên giá thành không cạnh trạnh

- Không phải bất cứ loài cây nào cũng có thể vi nhân giống

- Một số loài cây trồng rất dễ bị biến dị khi nhân giống invitro

 Ứng dụng của kỹ thuật nhân nhanh

- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác giống

- Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt

- Duy trì nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống rau, cây hoa và cây trồng khác.

- Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus

- Bảo quản nguồn gen invitro

 Các bước của quá trình nhân giống vô tính invitro

 Bước 0: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

- Trước khi tiến hành nhân giống invitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy).

- Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở các giai đoạn sinh trưởng mạnh

- Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy invitro

 Bước 1: Nuôi cấy khởi động

- Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy invitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt.

- Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: mô non, ít chuyên hóa (đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ...)

- Xác định chế độ khử trùng mẫu cấy thích hợp: thường dùng các chất: HgCl2 0.1% xử lý trong 5-10 phút, NaOCl, Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung dịch brom...

 Bước 2: Nhân nhanh

- Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính.

- Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi cấy thường là: 25-270C, 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-4000 lux

 Bước 3: Tạo cây invitro hoàn chỉnh

- Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng

- Đối với các phôi vô tính thường chỉ gieo chúng trên môi trường có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường chứa nồng độ thấp của cytokinin để phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh.

 Bước 4: Thích ứng cây invitro ngoài điều kiện tự nhiên

- Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu

- Cây trong ống nghiệm đã đạt một số tiêu chuẩn về hình thái nhất định: số lá, số rễ, chiều cao cây.

- Có giá thể tiếp nhận cây invitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước.

- Phải chủ động điều chỉnh được ẩm độ, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp.

 Các tồn tại của nhân giống cây trồng invitro

 Tính bất định về di mặt di truyền (genetic instability)

- Mục đích của nhân giống invitro là tạo ra quần thể cây đồng nhất với số lượng rất lớn. Tuy nhiên, trong một số trường hợp phương pháp này cũng tạo ra những biến dị soma. Tần số biến dị cũng hoàn toàn khác nhau và không lặp lại. Cây tạo ra do nuôi cấy tế bào mô sẹo có nhiều biến dị lớn so với nuôi cấy chồi đỉnh.

- Nhưng nhân tố gây ra biến dị tế bào soma có thể là:

 Kiểu di truyền (genotype): tần số biến dị ảnh hưởng bởi kiểu di truyền của các loài cây trồng khác nhau. Nói chung cây càng có mức độ bội thể cao thì càng dễ bị biến dị.

 Số lần cấy chuyển: số lần cấy chuyển càng nghiều thì độ biến dị càng cao. Theo Amstrong và Phillips (1988) khi nuôi cấy lâu dài thường gây ra biến dị nhiễm sắc thể.

 Loại mô: nói chung nuôi cấy chồi đỉnh trong nhân nhanh invitro ít biến dị hơn so với nuôi cấy các cơ quan khác.

 Sự nhiễm mẫu (explant contamination)

- Các vi sinh vật như nấm, vi khuẩn nói chung đều bị loại trừ khi khử trùng mẫu đưa vào nuôi cấy. Tuy nhiên, một số loại vi khuẩn như Agrobacterium, Bacillus, Corylabacterium, Erwinia, Pseudomonas có thể xâm nhập vào mô dẫn, tồn tại trong mô và bắt đầu gây tác hại khi tế bào bắt đầu phân chia sau 1-2 tuần nuôi cấy. Để khác phục hiện tượng trên cần:

 Lựa chọn cây mẹ đúng tiêu chuẩn

 Có thể sử dụng một số chất kháng sinh để chống hiện tượng nhiễm khuẩn và nấm. Nhưng mô thực vật rất mẫn cảm với kháng sinh và có phản ứng đến kiểu di truyền do đó cần rất thận trọng khi sử dụng kháng sinh. Chất kháng sinh thường gây ra những hủy hoại ở ty thể và lạp thể nên có ảnh hưởng đến di truyền tế bào chất.

 Việc sản sinh các chất độc từ mô nuôi cấy

- Trong nuôi cấy mô thường quan sát thấy hiện tượng hóa nâu hay đen mẫu, mẫu này có thể khuếch tán trong môi trường. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều chất tanin hoặc hydroxyphenol. Thí dụ các chất phenol eucomic acid và tyramine đã làm hóa nâu mẫu cây lan Cattleya khi nuôi cấy.

- Các phương pháp loại trừ sự hóa nâu:

 Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy (0.1-0.3%) phương pháp đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalenopsis, Cattleya và Aerides. Tuy nhiên, than hoạt tính có thể làm chậm quá trình nhân nhanh cây do hấp thụ một số chất điều tiết sinh trưởng và dinh dưỡng cần thiết khác.

 Bổ sung polyvinyl pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hóa tốt ở mẫu một số cây ăn quả (táo, hồng)

 Sử dụng mô non, gây vết thương nhỏ nhất khi khử trùng

 Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic và xytric vài giờ trước khi cấy.

 Nuôi cấy mẫu trong môi trưởng lỏng, oxy thấp, khônng có ánh sáng (1-2 tuần)

 Cấy chuyển liên tục (1-2 ngày/lần) sang môi trường tươi trong 1-2 tuần

 Hiện tượng thủy tinh hóa (vitrification)

- Cây bị "thủy tinh" thân lá mọng nước, trong suốt, cây rất khó sống khi đưa ra ngoài môi trường do mất nước mạnh

- Thường xảy ra khi nuôi cấy trong môi trường lỏng hay môi trường ít agar, sự trao đổi khí thấp. Đặc biệt thường xảy ra khi nuôi cấy táo, mận, hoa cẩm chướng, hoa đồng tiền và hoa cúc.

- Cây bị thủy tinh hóa thường có hàm lượng lớp sáp bảo vệ thấp, cấu tạo có nhiều phân tử phân cực nên dễ hấp thụ nước. Cây invitro thường có mật độ khí khôgnr cao,khí khổng có dạng tròn chứ không phải elip, khí khổng mở liên tục trong quá trình nuôi cấy.

- Để tránh hiện tượng thủy tinh hóa có thể tiến hành một số giải pháp.

• Giảm sự hút nước của cây bằng cách tăng nồng độ đường hoặc các chất gây áp suất thẩm thấu cao

• Giảm nồng độ các chất chứa nitơ trong môi trường

• Giảm sự sản sinh ethylene trong bình nuôi cấy

• Xử lý axit absixic hoặc một số chất ức chế sinh trưởng.

 Những công nghệ trong vi nhân giống cây trồng

 Công nghệ nhân giống cây trồng bằng quang tự dưỡng

- Là bước phát triển của công nghệ nuôi cấy mô tế bào do GS.T.Koyoki Kozai đề xuất và nghiên cứu từ hơn hai thập kỷ qua

- Công trình tập trung vào vấn đề nhân giống cây nuôi cấy trên môi trường không có đường nhưng được điều khiển chủ động chế độ ánh sáng và cung cấp CO2

- Công nghệ này đã được thử nghiệm thành công trên nhiều đối tượng cây trồng như cà chua, khoai lang, rau spinach, dưa chuột, xà lách, keo, cà phê, xoài, tre, thông...

- Công nghệ này đang được tiếp tục hoàn thiện để làm cơ sở cho hệ thống nhân giống công nghiệp hóa.

- Lợi ích của vi nhân giống sử dụng quang tự dưỡng

• Tốc độ sinh trưởng, chất lượng và tỷ lệ sống của mô thực vật nâng cao ở tất cả các bước trong nhân giống trong điều kiện tự dưỡng.

• Thiệt hại do sự nhiễm mẫu được hạn chế do không sử dụng đường trong môi trường

• Tự động hóa và do đó giảm được chi phí lao động

- Nhược điểm

• Chi phí cao cho việc điều khiển môi trường (ánh sáng, nhiệt độ, CO2, O2)

• Cây vẫn sinh trưởng trong điều kiện vô trùng vì vậy dẫn đến chi phí cao cho hệ thống bình nuôi chuyên dụng và chuẩn bị giá thể.

 Bioreactor

• Sự phát triển của công nghệ bioreactor trong vi nhân giống cây trồng

- Takayama và Miasawa là những người đầu tiên nghiên cứu sử dụng bioreactor vào nhân giống cây trồng: nhân củ siêu nhỏ khoai tây, củ giống hoa ly (Takayama và Akita, 1988), hoa lan hồ điệp (Yong et al, 2000; Datta et al, 1999), cỏ ngọt với công suất 2000 chồi/bình bioreactor 500 lít (Takayama và Akita, 1994)...

- Công nghệ này cho phép nhân nhanh vô hạn các giống cây trồng nhờ thiết bị bioreactor hoàn toàn tự động hóa. Ví dụ một bioreactor vibro-mixer (rung và trộn) trang bị các ống silicone sục khí tự do đã có khả năng sản xuất 100000 phôi vô tính của cây trạng nguyên trong một lít dung dịch huyền phù nếu như dung dịch đó được đặt trên một tấm giấy lọc và phát triển trong 4 tuần (Preil và cộng sự, 1988).

- Tuy nhiên, công nghệ này đòi hỏi thiết bị hiện đại và đắt tiền, vận hành phức tạp đặc biệt là khâu chống ô nhiễm cho huyền phù nuôi cấy.

• Thuận lợi của hệ thống bioreactor so với nuôi cấy trong bình

- Thuận lợi thứ nhất là thể tích nuôi cấy tăng, thường ít nhất là 1 lít. Điều này cho phép sản xuất nhiều phôi, chồi hơn mà không cần những kỹ thuật cao cấp.

- Thuận lợi thứ hai, hầu hết các bình bioreactor được thiết kế với một cơ chế khuấy, bằng cơ học hay bằng bình thổi khí, để duy trì nuôi cấy gần như đồng dạng.

- Thuận lợi thứ ba, khi thao tác nuôi cấy liên tục, môi trường nuôi cấy và môi trường vật lý có thể được kiểm soát thích hợp cho sinh trưởng. Có những chỉ dẫn về các nhân tố môi trường như pH và oxygen hòa tan. Điều này không thể thực hiện được với hệ thống nuôi cấy bình tam giác.

• Cách nhân giống bằng bioreactor: bioreactor có thể được ứng dụng để vi nhân giống thực vật quy mô thương mại theo 3 hướng:

- Tạo chồi (chuối, dứa, hoa lan...)

- Tạo củ invitro (khoai tây, lily...)

- Tạo phôi soma (cà phê, cao su...)

9. Vì sao có thể tạo cây sạch bệnh virus bằng nuôi cấy mô phân sinh đỉnh của cây nhiễm virus. Trình bày kỹ các kỹ thuật tạo cây sạch bệnh bằng nuôi cấy invitro. Ý nghĩa của việc duy trì sự sạch bệnh cho cây trồng. Các biện pháp tránh tái lây nhiễm bệnh

9.1 Nuôi cấy meristem trong làm sạch virus cho cây trồng

 Việc tạo ra các cây giống sạch virus là biện pháp bắt buộc phải tiến hành cho tất cả các cây nhân giống vô tính và cũng là một biện pháp phục tráng giống cho các giống đã bị thoái hóa do virus.

 Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ hữu hiệu. Có hai cách chính để tạo cây sạch virus nhờ công nghệ này:

- Dùng các phương pháp chuẩn đoán virus để thanh lọc các mẫu nhiễm bệnh trước khi đưa vào nuôi cấy, sử dụng biện pháp nhân nhanh invitro để nhân nhanh mẫu sạch.

- Làm sạch virus ở mẫu đã bị nhiễm, sau khi đã tạo mẫu sạch thì tiếp tục sử dụng biện pháp nhân nhanh ivitro để nhân mẫu sạch.

9.2.1 Nguyên lý của làm sạch virus quan nuôi cấy meristem

 Virus tồn tại ở mọi tế bào sống. Tuy nhiên, những nghiên cứu của White (1934), Limasset và Cornuet (1950), Morel và Martin (1952) cho thấy:

 Nồng độ virus trong tế bào các cây bị bệnh phụ thuộc vào tốc độ phân chia tế bào và khả năng sinh trưởng của tế bào. Tế bào càng phân chia mạnh thì nồng độ virus càng thấp, nghĩa là những tế bào càng gần đỉnh sinh trưởng thì càng chứa ít virus hơn.

 Từ đây các ông đề xuất kỹ thuật nuôi cấy meristem (mô phân sinh đỉnh) để tạo ra cây hoàn toàn sạch virus từ cây đã nhiễm bệnh.

 Cụ thể:

- White (1934) đã sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo để nghiên cứu sự phân bố virus trong rễ cây cà chua bị bệnh virus Aucuba gây khảm thuốc lá. Kết quả cho thấy 2cm ở đầu rễ hầu như không phát hiện ra virus.

- Limasset và Cornuet (1950) đã dùng phương pháp huyết thanh định lượng, chứng minh được sự tồn tại một gradient nồng độ virus từ các mô non đến các mô già ở cây thuốc lá bị bệnh. Nồng độ virus bằng không ở mô đỉnh lá và bao lá thứ nhất sau đó tăng dần, đạt cực đại ở lá thứ năm rồi giảm dần ở các lá già phía dưới.

9.2.2 Giả thiết về sự không tồn tại virus ở meristem.

 Theo Mathews (1970), Wang et al Hu (1980) meristem (mô phân sinh đỉnh) không có virus có thể do các lý do sau:

 Virus vận chuyển chủ yếu trong cây nhờ hệ thống mô dẫn, hệ thống này không có ở mô phân sinh đỉnh.

 Trong sự phân chia, các tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép sao chép các thông tin di truyền của virus.

 Nồng độ auxin, cytokinin cao ở đỉnh sinh trưởng có thể ngăn cản quá trình sao chép virus.

 Hệ thống vô hiệu hóa virus ở vùng meristem mạnh hơn các vùng khác trong cây.

9.3 Các kỹ thuật làm sạch virus invitro

9.3.1 Nuôi cấy meristem:

 Tách chính xác meristem có kích thước

9.3.2 Nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý nhiệt độ cao

 Ở nhiệt độ cao từ 36-370¬¬C thì một số loài virus không có khả năng nhân lên. Lợi dụng đặc tính này có thể kết hợp phương pháp nuôi cấy meristem với xử lý nhiệt độ để tẩy sạch virus khuôn mẫu.

 Biện pháp này cho phép có thể tách meristem ở kích thước lớn hơn (0.5-1mm) giúp cho việc tách và tái sinh cây thuận lợi hơn so với phương pháp tách ở kích thước 0.1-0.2mm

 Cụ thể:

 Có thể xử lý nhiệt độ cao 36-370C một thời gian dài (4-6 tuần) cho cây mẹ, sau đó tách meristem có kích thước 0.5-1.0mm để nuôi cấy invitro.

 Có thể tách meristem có kích thước 0.5-1.0 mm đưa vào nuôi cấy invitro, sau đó xử lý ở nhiệt độ 39-400C trong 1-2 tuần. Ở nhiệt độ này, thường các mARN của virus sẽ bị phân giải và cây tái sinh sẽ có độ sạch virus cao.

9.3.3 Nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý hóa chất.

 Có thể nuôi cấy meristem với kích thước lớn (0.5-1.0mm) kết hợp với việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất kháng virus để tạo cây sạch bệnh.

 Các chất kháng virus như: 2-thiouracil, ribavirin, vidarabin làm tăng khả năng kháng của tế bào, mô thực vật và ức chế sự nhân bản của virus.

 Phương pháp này có hiệu quả trong tạo cây sạch virus ở thuốc lá, khoai tây, loa kèn.

9.3.4 Vi ghép

 Là kỹ thuật ghép các mô phân sinh đỉnh lên gốc cây sạch và kháng bệnh trong điều kiện invitro để sản xuất cây sạch virus.

 Kỹ thuật này thường sử dụng với các cây thân gỗ, đặc biệt là họ cam, chanh vì meristem của chúng không thể sinh trưởng và tái sinh chồi khi nuôi cấy trực tiếp trên môi trường nhân tạo.

9.4 Ý nghĩa của việc duy trì sự sạch bệnh cho cây trồng và các biện pháp tránh tái lây nhiễm

 Việc duy trì tình trạng sạch bệnh virus cho cây trồng có ý nghĩa rất quan trọng trong sản xuất do virus có thể lây lan rất nhanh khi một cây nhiễm bệnh chúng sẽ lan truyền và gây hại trên cả diện tích rộng lớn và do đó giống cây trồng đó bị nhiễm virus sẽ di truyền qua thế hệ sau qua hạt giống hoặc tồn tại sẵn trong môi trường làm giảm năng suất đáng kể và thoái hóa giống do đó việc duy trì sự sạch bệnh cho cây trồng có ý nghĩa quan trọng.

 Các biện pháp ngăn chặn quá trình tái lây nhiễm

 Cây trồng nên được trồng trong nhà cách ly (nhà màn, nhà kính) không chứa các nguồn bệnh và các vector truyền bệnh (rệp) hay ở nơi tự nhiên không có mang các virus.

 Cần loại trừ thường xuyên các nguồn lây nhiễm, cần phòng trừ các vật mang bệnh (côn trùng, tuyến trùng...).

 Phòng tránh sự lây nhiễm cơ giới trong quá trình chăm sóc cây trồng.

 Thường xuyên chọn lọc, có thể bằng mắt và qua các phân tích chẩn đoán.

 Để hoàn toàn chắc chắn, nên duy trì vật liệu sạch bệnh invitro.

9.5 Các phương pháp chẩn đoán bệnh virus.

 Chẩn đoán bằng mắt

 Chẩn đoán bằng cây chỉ thị

 Phương pháp huyết thanh

 Phương pháp kính hiển vi điện tử

 Phương pháp ELISA

 Phương pháp lai ADN

10. Khái niệm cây đơn bội. Ý nghĩa trong di truyền thực vật và trong công tác giống cây trồng. Trình bày nguyên lý các bước tiến hành và những nhân tố ảnh hưởng đến việc tạo cây đơn bội invitro nhờ nuôi cấy bao phấn, hạt phấn, noãn chưa thụ tinh. Trình bày ví dụ để minh họa cho phương pháp nêu trên.

1.1 Khái niệm về cây đơn bội

 Các thể đơn bội là những cá thể thường là của những loài nhị bội hay đa bội khác nguồn mà trong tế bào soma của chúng số lượng nhiễm sắc thể bằng một nửa số lượng nhiễm sắc thể của loài khởi đầu, trong mỗi cặp nhiễm sắc thể tương đồng, nó chỉ có một nhiễm sắc thể.

 Người ta biết đến một số cách khác nhau trong hình thành thể đơn bội và chúng được chia thành 3 nhóm:

- Trinh sinh (parthogenesis) và sinh sản đơn tính đực (androgenesic)

- Loại trừ nhiễm sắc thể và giảm nhiễm sắc thể soma

- Nuôi cấy thể đơn bội invitro

1.2 Ý nghĩa của cây đơn bội trong di truyền thực vật và trong công tác giống cây trồng

 Nghiên cứu di truyền về mối tương quan của các gen

 Nghiên cứu sự tương quan kiểu hình và kiểu gen

 Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ công tác giống cây trồng

Sơ đồ các hướng ứng dụng của cây đơn bội

1.3 Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn.

1.3.1 Nguyên lý:

 Dựa trên cơ sở của sự sinh sản đơn tính đực (androgensis) người ta nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phấn đơn nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích các hạt phấn này phát triển thành cây đơn bội.

 Các phương thức sinh sản đơn tính đực invitro:

- Sinh sản đơn tính trực tiếp: ví dụ ở thuốc lá, cà độc dược: hạt phấn đơn nhân  phôi 1n  cây đơn bội 1n

- Sinh sản đơn tính gián tiếp: ví dụ ở lúa, ngô...hạt phấn đơn nhân  mô sẹo 1n  chồi 1n  cây 1n.

- Sinh sản đơn tính đực hỗn hợp: quá trình này diễn ra tương tự như sinh sản đơn tính đực gián tiếp, nhưng sự hình thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết, ví dụ ở cây cà chua.

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy bao phấn, hạt phấn

 Kiểu gen:

- Kiểu gen đóng vai trò chính quyết định sự thành công hay thất bại của thí nghiệm.

- Sản xuất cây đơn bội bằng con đường nuôi cấy hạt phấn là rất hạn chế và không áp dụng được cho một số loài. Ngoài ra, trong cùng một loài khả năng sản sinh cây đơn bội là cũng khác nhau. Thí dụ một số dòng ngô (Zea mays L.) là hoàn toàn không có khả năng nuôi cấy hạt phấn trong khi một số ít các cây đơn bội có thể thu được từ một số dòng khác.

- Do tác dụng của kiểu gen, việc sử dụng càng nhiều sự đa dạng về di truyền sẽ càng tốt khi triển các quy trình để sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy hạt phấn.

 Tình trạng cây mẹ:

- Tuổi và sinh lý của cây mẹ ảnh hưởng đến kết quả của việc nuôi cấy hạt phấn.

- Với hầu hết các loài, lượt hoa sản sinh đầu tiên thường cho kết quả tốt nhất. Như một nguyên tắc chung, các hạt phấn cần được nuôi cấy từ nụ thu từ các lứa càng sớm càng tốt.

- Các yếu tố môi trường khác nhau mà các cây mẹ đang trải qua cũng có thể sẽ ảnh hưởng đến sự tạo cây đơn bội. Cường độ ánh sáng, quang chu kỳ và nhiệt độ đã được nghiên cứu và kết luận là có ảnh hưởng đến số lượng cây tái sinh từ nuôi cấy hạt phấn. Các điều kiện sinh trưởng đặc trưng là khác nhau tùy vào các loài khác nhau. Nói chung, các kết quả tốt nhất thường thu được từ các cây mẹ khỏe mạnh, sinh trưởng tốt.

 Giai đoạn phát triển hạt phấn

- Yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự sản xuất cây đơn bội từ hạt phấn là giai đoạn phát triển của hạt phấn.

- Đối với rất nhiều loài, hạt phấn trong giai đoạn đơn nhân cho phản ứng tạo cây đơn bội tốt nhất.

- Ngược lại, ở thuốc lá phản ứng thích hợp chỉ thu được khi nuôi cấy hạt phấn ở giai đoạn ngay trước, trong và ngay sau khi quá trình phân bào đầu tiên (giai đoạn tiểu bào tử chuyển từ trạng thái đơn nhân sang hai nhân).

 Xử lý trước khi nuôi cấy:

- Xử lý nhiệt độ cho các nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và trước khi tách bao phấn để cấy sẽ kích thích sự phân chia của tiểu bào tử để tạo cây đơn bội. Đối với bất kỳ một loài, có thể các tổ hợp thích hợp giữa nhiệt độ và thời gian xử lý. Thông thường nhiệt độ thấp yêu cầu thời gian xử lý ngắn hơn và ngược lại. Ví dụ

 Năng suất của cây thuốc lá đơn bội thường tăng lên bằng việc xử lý nụ ở 7-80C trong thời gian 12 ngày hay ở 2-50C trong 2-3 ngày trước khi tách và nuôi cấy hạt phấn. Đối với các loài khác, nhiệt độ từ 4-100C trong 3 ngày đến 3 tuần đã được sử dụng.

 Nhiệt độ cao trước khi nuôi cấy có hiệu quả ở một số loài, ví dụ sản xuất cây đơn bội đã tăng lên ở nho khi nuôi cấy hạt phấn ở nhiệt độ từ 350C từ 1-3 ngày trước khi nuôi cấy ở 250C.

 Môi trường nuôi cấy

- Cây đơn bội có thể được cảm ứng tạo ra trên môi trường đơn giản như là môi trường Nitsch và Nistch (1969) cho thuốc lá và một số loài khác.

- Với hầu hết các loài, môi trường phổ biến nhất dùng cho nuôi cấy hạt phấn là MS và N6 hay các dạng biến đổi từ hai môi trường này.

- Các hỗn hợp chất tự nhiên như: dịch chiết khoai tây, nước dừa...tỏ ra có tác dụng tốt trong nhiều môi trường nuôi cấy bao phấn.

- Nguyên tố đa lượng và vi lượng ít có ảnh hưởng trong nuôi cấy bao phấn.

- Hàm lượng đường cao giúp làm tăng tính thẩm thấu hơn là nhu cầu dinh dưỡng (áp suất thẩm thấu trong bao phấn thường khá cao). Các đường khác như ribose, maltose và glucose tỏ ra là rất tốt hơn so với saccarose ở một số loài.

- Bổ sung chất điều tiết sinh trưởng vào môi trường: đa số yêu cầu bổ sung một lượng nhỏ các auxin. Cytokinin đôi khi cũng cần thiết và được sử dụng kết hợp với auxin, đặc biệt là cho các loài mà tạo callus là giai đoạn trung gian trong quá trình sản xuất cây đơn bội.

- Agar có thể chứa các hợp chất ức chế đến quá trình sinh sản vô tính đực ở một số loài. Agarose được xem là yếu tố làm đông môi trường ưu việt hơn.

1.3.3 Các phương pháp nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

 Nuôi cấy bao phấn trên môi trường đặc: callus và cây đơn bội xuất hiện trên bề mặt bao phấn.

 Nuôi cấy bao phấn trong môi trường lỏng và lắc: hạt phấn giải phóng vào môi trường, callus và cây đơn bội xuất hiện từ hạt phấn.

 Nuôi cấy hạt phấn tách rời trong môi trường lỏng và lắc hoặc trong môi trường bán lỏng: callus và cây đơn bội xuất hiện từ hạt phấn.

1.3.3.1 Các bước tiến hành nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội

 Chọn bao phấn: tốt nhất là chọn bao phấn chứa hạt phấn ở giai đoạn sắp phân bào nguyên nhiễm lần một. Bao phấn của những hoa đầu tiên của cây cho kết quả cao hơn hoa muộn.

 Xử lý nụ hoa: xử lý lạnh sẽ kích thích nhân dinh dưỡng phân chia. Chế độ xử lý nhiệt độ phụ thuộc vào loại cây. Ví dụ: Japonica xử lý ở 100C trong 2-3 tuần, lúa Indica xử lý ở 70C trong 1 tuần, ngô xử lý ở 40C trong 1 tuần...

 Chọn môi trường nuôi cấy thích hợp: tùy theo đối tượng nuôi cấy khác nhau mà sử dụng môi trường tương ứng. Tuy nhiên có một số quy luật chung:

- Các cây hòa thảo cần nhiều auxin, đặc biệt là 2,4 D ở nồng độ cao để khởi động sự phân chia đầu tiên (đối với lúa mỳ: 10-5 mol 2,4 D trong 12 ngày), cây họ cà cần ít hơn (10-6¬¬ ¬¬¬¬¬mol).

- Hàm lượng đường cao: đối với ngô 60-120g saccaroza/l, lúa 50-60g saccarose/l, cây họ cà cần 20-40g/l.

- Bổ sung các hỗn hợp chất tự nhiên: nước dừa, pepton...

1.3.3.2 Các bước nuôi cấy hạt phấn tạo cây đơn bội

 Kỹ thuật tách rời tiểu bào tử:

- Các bao phấn vô trùng được nghiền hoặc ép trong môi trường lỏng để giải phóng hạt phấn ra ngoài bao phấn. Tách hạt phấn ra khỏi bã túi phấn bằng cách rót dung dịch trên qua lưới lọc có kích thước phù hợp.

- Dung dịch sau lọc được ly tâm 800-1000rpm trong 3-5 phút để tách và làm sạch hạt phấn. Thành phần nhẹ nổi trên được gạn đi trong khi hạt phấn lắng dưới đáy được rửa sạch bằng môi trường mới và được ly tâm thêm 2 lần nữa để loại bỏ các chất ức chế trong túi phấn.

- Tạo huyền phù hạt phấn với mật độ 104-105 tế bào/ml

 Một số chú ý khi nuôi cấy hạt phấn

- Các hạt phấn nuôi cấy tách rời thường phát sinh phôi trực tiếp

- Để kích thích sự phát sinh phôi thường sử dụng phương pháp nuôi "trợ dưỡng": nuôi kèm với bao phấn hay loại mô khác của cây mẹ.

- Môi trường nuôi cấy hạt phấn cần bổ sung các axit amin (glutamine, serine...) với nồng độ cao (100-1000ppm) và có trường hợp không cần dùng chất điều tiết sinh trưởng (thuốc lá, cải dầu...)

2. Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh

2.1 Khái niệm:

 Sự hình thành cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh được gọi là sự sinh sản đơn tính cái hay trinh nữ (parthogenesis). Cây đơn bội từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh được hình thành do kích thích tế bào trứng hay các tế bào cực, tế bào đối cực, tế bào kèm trong noãn phát triển và tái sinh tạo thể đơn bội.

 Những năm 70 các nhà nghiên cứu đã tập trung giải quyết vấn đề tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh và đã thu được một số thành tựu trên các đối tượng hành, củ cải đường, hướng dương, ngô....

2.2 Các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy noãn chưa thụ tinh

 Kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn nhiều khó khăn phức tạp do việc tách noãn rất khó và dễ gây tổn thương.

 Nhằm tăng hiệu quả của quá trình này, người ta tập trung nghiên cứu các yếu tố như kiểu gen cây mẹ, giai đoạn phát triển của túi phôi, chế độ xử lý nhiệt độ, môi trường nuôi cấy...

- Kiểu gen của cây mẹ: là một trong những nhân tố quan trọng nhất nhất đối với sự cảm ứng tạo cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh.

- Ảnh hưởng của sự sai khác kiểu gen đến kết quả nuôi cấy đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau: lúa, hoa đồng tiền, lúa mỳ, củ cải đường...

- Người ta nhận thấy mỗi kiểu gen có phản ứng khác nhau trong sinh sản đơn tính cái invitro nên cẩn phải xác định quy trình tối ưu tiên cho từng kiểu gen.

 Giai đoạn phát triển của noãn: giai đoạn phát triển của noãn khi đưa nuôi cấy có ý nghĩa đặc biệt đối với việc tạo thể đơn bội.

 Nhiều tác giả xác nhận rằng giai đoạn túi phôi thành thục là giai đoạn phù hợp và cho hiệu quả cao trong nuôi cấy noãn.

 Tuy nhiên, việc xác định giai đoạn phát triển của thể giao tử cái rất phức tạp vì túi phôi nằm sâu trong bầu quả. Do khó có thể quan sát trực tiếp, để xác định giai đoạn phát triển của noãn thường phải sử dụng các phương pháp tế bào học: tách túi phôi, nhuộm màu lát cắt mỏng...

 Môi trường nuôi cấy:

- Các môi trường nuôi cấy như: MS (Murashige Skoog, 1962), B5 (Gamborg et al, 1968), MF (muối khoáng của Miller và vitamin của Fujii)...thường được sử dụng trong nuôi cấy noãn chưa thụ tinh.

- Dạng môi trường sử dụng chủ yếu là môi trường đặc.

- Để cảm ứng sự trinh sinh cần thiết phải bổ sung vào môi trường các chất điều tiết sinh trưởng thực vật.

- Nồng độ đường của môi trường nuôi cấy là một yếu tố quan tâm. Nồng độ đường dao động tùy theo đối tương nuôi cấy, ví dụ đối với lúa nồng độ đường phù hợp là 3-6%, đối với hành là 10%...

- Trong nhiều trường hợp, việc bổ sung nước dừa vào môi trường làm gia tăng khả năng tạo callus phát sinh phôi và tái sinh cây.

 Điều kiện nuôi cấy:

- Quá trình nuôi cấy thường được duy trì ở nhiệt độ ổn định 25-280C

- Đối với đa số loài, thường giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy (tạo callus) tiến hành trong điều kiện tối, giai đoạn tái ính cây tiếp theo sau yêu cầu chiếu sáng 2000-3000 lux.

- Tỷ lệ tạo cây đơn bội bằng con đường trình nữ sinh biến động ở các loại cây khác nhau. Đối với hành, củ cải đường tỷ lệ này là 5-20%, ở lúa 1,5-12%, ở dâu tằm 3-6%...

- Một lợi thế của con đường này là các cây tái sinh rất ít bị bạch tạng. Ngay cả với các loài hòa thảo, hầu như các cây tái sinh khi nuôi cấy noãn chưa thụ tinh đều là cây xanh. Trong khi trên các đối tượng này các cây tái sinh từ nuôi cấy bao phấn và hạt phấn có tỷ lệ cây bạch tạng chiếm tới 60-90%.

11. Tế bào trần là gì? Vì sao cần đến tế bào trần. Thế nào là lai tế bào soma và khả năng ứng dụng của kỹ thuật lai tế bào soma trong công tác giống cây trồng. Trình bày các kỹ thuật tách, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần. Nêu một ví dụ về khả năng ứng dụng của tế bào trần (Một quy trình cụ thể minh chứng cho khả năng đó)

11.1. Giới thiệu chung

 Tế bào trần (protoplast) là tế bào thực vật bị tách thành tế bào, chỉ còn phần nguyên sinh chất, nhân, các cơ quan tử khác và màng sinh chất là ranh giới phân biệt bên trong và bên ngoài tế bào trần.

 Kỹ thuật tách protoplast do Cocking khởi xướng 1960, sau đó đã được cải tiến và sử dụng thành công trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau. Đặc biệt là trên các cây họ cà và họ hòa thảo.

 Protoplast là cơ sở quan trọng cho các biện pháp lai soma và chuyển nạp gen nhằm cải tạo các giống cây trồng này.

11.2. Phương pháp tách tế bào trần bằng enzyme.

11.2.1 Nguyên tắc:

 Sử dụng hỗn hợp enzym: cellulolase, hemicellulolase và pectinase để phân giải thành tế bào và giải phóng các tế bào trần.

 Một nguyên tắc cơ bản là sau khi thành tế bào được tách ra, tế bào trần phải được phóng thích vào môi trường có áp suất thẩm thấu cao để tránh nước xâm nhập vào không bào gây vỡ tế bào chất, bằng việc bổ sung các chất tạo áp suất thẩm thấu như saccarose, mannitol, sorbitol, Ca2+...

 Nồng độ chất tạo áp suất thẩm thấu và thời gian lưu giữ tối đa thay đổi cho thích hợp với từng đối tượng cây trồng.

 Đây là phương pháp dùng phổ biến và có hiệu quả từ 1g lá tươi có thể thu nhận được từ 6-12 triệu tế bào trần.

11.2.2 Các bước tiến hành:

 Chọn nguyên liệu: ex vitro: mô lá non (cần phải khử trùng), invitro: lá, mô sẹo, tế bào huyền phù.

 Xử lý gây co nguyên sinh chất (CaCl2, đường mannitol ..0,5-0,7M).

 Xử lý hỗn hợp enzyme (cellulolase, hemicellulolase, pectinase).

 Tách và làm sạch protoplast: lọc, ly tâm.

 Kiểm tra khả năng sống (fluorescein diacetate) và tạo huyền phù protoplast có mật độ phù hợp (104-107/ml).

11.2.3 Ví dụ về kỹ thuật tách tế bào trần

 Ở cây thuốc lá:

 Nguyên liệu thực vật lá thứ ba từ trên xuống.

 Hỗn hợp enzyme: cellulolase 1%, macerozyme 0,02%, driselase 0,05%.

 Thời gian ngâm ủ 16 giờ ngâm qua đêm.

 Ở cây ngô

 Nguyên liệu thực vật tế bào hạt phấn

 Hỗn hợp enzyme: cellulolase 2%, macerozyme 0,1%, pectolyase 0,05%

 Thời gian ủ: 4-12 giờ ngâm qua đêm.

 Các tế bào trần sau khi tách thành tế bào được lọc qua rây có kích thước 50-80 µm, rồi rửa bằng dung dịch không có enzyme bằng ly tâm.

11.3. Nuôi cấy protoplast.

 Thường chia làm hai giai đoạn:

 Giai đoạn 1: nuôi cấy để protoplast tái sinh thành (vỏ) tế bào và phân chia tạo cụm nhỏ tế bào (4-10 tế bào) nuôi cấy trong tối hay điều kiện ánh sáng yếu, trong môi trường lỏng có lắc hay môi trường bán lỏng. Môi trường cần giàu dinh dưỡng và áp suất thẩm thấu phù hợp. Nhiều trường hợp cần dùng lớp nuôi trợ dưỡng.

 Giai đoạn 2: nuôi cấy tạo mô sẹo ổn định và tái sinh cây hoàn chỉnh: nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng tốt với quang chu kỳ phù hợp, trên môi trường đặc. Cần chú ý đến hàm lượng và tỷ lệ auxin và cytokinin để tái sinh được cây từ callus.

 Có hai con đường phát sinh hình thái trong quá trình hình thành cây hoàn chỉnh đối với các tế bào có nguồn gốc protoplast.

 Thông qua quá trình phát sinh cơ quan (organogenesis): ví dụ tế bào protoplast có nguồn gốc từ mô thịt lá của cây thuốc lá.

 Thông qua con đường phát sinh phôi (somatic embryogenesis): ví dụ các tế bào protoplast có nguồn gốc từ các tế bào phôi được nuôi cấy dạng huyền phù một số loài cây thuộc họ hòa thảo.

 Nếu đảm bảo được các môi trường nuôi cấy phù hợp, thì phôi và các mô phân sinh sẽ hình thành sau khoảng 3-5 tuần lễ. Nhưng nếu điều kiện nuôi cấy không tối ưu, các biến đổi di truyền có thể xảy ra. Ví dụ: trong một số nghiên cứu nuôi cấy protoplast từ cây khoai tây, tần số cây 2n được tái sinh chỉ khoảng 10%, còn lại chủ yếu là cây 4n.

11.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của tế bào trần

11.4.1 Môi trường nuôi cấy.

 Ammonium nitrate là cần thiết để kích thích phân chia tế bào nhưng lại độc đối với protoplast ở các nồng độ (20mM) mà hiện đang được sử dụng trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô. Vì thế nồng độ ammonium nitrate thường được giảm đi từ 1/4 đến 1/2 so với bình thường.

 Calcium được tăng lên trong hầu hết các quy trình nuôi cấy protoplast từ 14 đến 40mM sẽ kích thích quá trình phân chia sớm, đồng hóa tế bào, giảm sự kết tụ và hạn chế quá trình nâu hóa của protoplast trong giai đoạn nuôi cấy ban đầu.

 Các thành phần hữu cơ như insitol, nicotinic acid, pyridoxine, thiamin, glycine, folic acid và biotin là các thành phần vẫn thường được sử dụng trong các môi trường nuôi cấy mô.

 Casein hydrolysate, D-Ca-pantothenate, choline chloride, cysteine, malic acid, ascorbic acid, adenine sulfate, riboflavin và glutamine thường được dùng trong môi trường nuôi cấy protoplast ở lượng nhỏ (0.01 đến 10mg/l) để làm nhanh sự tổng hợp vỏ tế bào và kích thích phân chia tế bào. Hầu hết các hợp chất này không cần sử dụng nữa sau khi protoplast đã hình thành vỏ tế bào mới và phân chia.

 Các chất điều tiết sinh trưởng ngoại sinh là cần thiết để kích thích phân chia tế bào. Cả auxin và cytokinin đều được sử dụng. Loại và nồng độ khác nhau tùy vào loài và cách thức tái sinh.

 NAA và 2,4 D ở 0.45 đến 10.7 µM là 2 auxin và nồng độ đặc trưng.

 BA và zeatin là 2 cytokinin thường sử dụng ở nồng độ 2-5 µM.

 Nước dừa cũng được dùng thay thế cho cytokinin ở nồng độ từ 20 đến 40 ml/l

 Đường thường có vai trò như những chất ổn định thẩm thấu và cung cấp nguồn cacbon.

 Mannitol, sorbitol thường dùng như các chất thẩm thấu ở nồng độ từ 0.3-0.7M. Các đường thẩm thấu thường được loại bỏ đi khi các cụm tế bào đủ lớn để có thể nhìn thấy được.

 Sucrose và glucose được sử dụng như nguồn cacbon ở nồng độ 0.2 đến 0.6 M. Nồng độ đường được giảm dần sau sự tổng hợp vỏ tế bào mới và phân chia.

11.4.2 Điều kiện nuôi cấy.

 Cường độ ánh sáng: protoplast rất nhạy cảm với ánh sáng và có thể được nuôi cấy trong tối hay đặt trong điều kiện ánh sáng đã lọc bớt (5 đến 30µmol.m-2.s-1) cho đến khi chúng tổng hợp vỏ tế bào mới và phân chia. Ở thời điểm này có thể tăng cường độ ánh sáng (30-300 30µmol.m-2.s-1).

 Chất lượng ánh sáng: ánh sáng trắng thường là tốt nhất về ánh sáng xanh hay đỏ có thể ức chế sự hình thành chồi.

 Nhiệt độ: các protoplast thường được nuôi cấy ở 20-250C.

11.5. Phương pháp dung hợp tế bào trần

11.5.1 Phương pháp dùng hóa chất.

 Năm 1972, Carlson tái sinh thành công cây thuốc lá từ tế bào trần protoplast dung hợp trong môi trường bổ sung NaNO3.

 Năm 1974, Melchers phát triển ra môi trường dung hợp tế bào trần gồm 50mM Ca2+, 0,4M mannitol, pH 10,5 tỏ ra thích hợp cho việc dung hợp tế bào trần nhiều loài cây trồng khác nhau.

 Năm 1974, Kao phát hiện ra PEG (polyethylene glycol) có tác dụng làm tăng hiệu quả của dung hợp protoplast. Khi được ngâm vào dung dịch PEG (20-40% w/v), các protoplast kết dính lại với nhau. Sau đó, khi PEG được rửa bằng dung dịch Ca2+ có độ pH cao, màng nguyên sinh chất ở chỗ tiếp xúc sẽ vỡ ra và các protoplast sẽ dung hợp với nhau. Do PEG độc đối với tế bào, nồng độ PEG thường được giảm đi và bổ sung thêm vào đó là DMSO (dimethyl sulfuside).

11.5.2 Phương pháp dùng xung điện

 Zimmerman (1982) là người đầu tiên đề xuất phương pháp dung hợp tế bào trần bằng xung điện (electrofusion).

 Trong phương pháp này, sự dung hợp xảy ra khi các tế bào trần được đưa vào điện trường có điện thế cao (500-1000V/cm) trong một thời gian phát xung cực ngắn (5-6/1000 giây).

 Nguyên tắc: các protoplast tích điện nên dịch chuyển trong điện trường và tạo thành chuỗi giữa hai thanh điện cực, dùng xung điện để làm thủng màng của hai protoplast sát cạnh nhau khiến chúng hòa trộn vào nhau.

 Thiết bị: máy tạo xung điện, kính hiển vi đảo pha, buồng dung hợp.

 Tạo điện trường: đặt trong buồng dung hợp các điện cực platin có khoảng cách 0,2-1,0mm và nối với nguồn điện có hiệu điện thế 200V/cm.

 Tạo xung: hiệu điện thế: 500-1000V/cm, thời gian cực ngắn 1-200 milisecond.

 Hiệu quả dung hợp cao nhưng thiết bị đầu tư lớn.

11.6. Khả năng xảy ra khi dung hợp.

 Về lý thuyết, khi tiến hành dung hợp protoplast của hai cây khác nhau, ta sẽ thu được kiểu tế bào dị nhân (heterokaryocyte), trong đó có sự trộn lẫn cả nhân và tế bào chất (bao gồm cả các cơ quant tử như ty thể, lạp thể).

 Song thực tế, ngoài dạng dung hợp này còn có các dạng dung hợp khác, bao gồm:

 Nhân của hai tế bào dung hợp, nhưng một trong hai tế bào chất bị thải loại (ít xảy ra).

 Chỉ một phần hệ gen nhân của tế bào bố/mẹ dung hợp với hệ gen nhân của tế bào thể nhận (dạng dung hợp nhân lệch - asymetric hybrid).

 Chỉ có sự dung hợp các cơ quan tử trong tế bào chất, không có sự dung hợp nhân (dạng dung hợp tế bào chất cybrid).

11.7. Ứng dụng của tế bào trần.

 Protoplast được ứng dụng vào 3 mục đích chính:

 Dung hợp protoplast (lai soma).

 Chọn dòng tế bào.

 Biến nạp di truyền: chuyển cơ quan tử, ADN ngoại lai vào protoplast.

11.7.1 Lai tế bào soma là gì.

 Khi hai hay nhiều tế bào trần dung hợp với nhau sẽ hợp thành một. Quá trình đó gọi là dung hợp tế bào trần hay dung hợp protoplast.

 Nếu các tế bào trần có nguồn gốc từ các tế bào soma (tế bào sinh dưỡng) thuộc các giống, loài, hoặc chi khác nhau dung hợp với nhau thì gọi là hiện tượng dung hợp tế bào soma hay lai soma.

11.7.2 Dung hợp protoplast.

 Chọn lọc thể lai vô tính:

 Do lai ngẫu nhiên nên có thể xảy ra:

• A + B → AB

• A + A → AA

• B + B → BB

 Cách chọn lọc thể lai vô tính:

• Phương pháp tế bào học.

• Phân tích isozyme.

• Lai ADN, PCR

• Trồng cây tái sinh và đánh giá các đặc điểm nông sinh học...

11.8. Các kỹ thuật lựa chọn sản phẩm dung hợp.

 Để làm tăng khả năng tái sinh cây lai, người ta thường sử dụng một số phương pháp chọn lọc nhằm tăng tỷ lệ các tế bào dị nhân.

1. Dựa vào sự khác biệt về mặt hình thái: phương pháp này dựa trên sự khác biệt giữa protoplast có nguồn gốc khác nhau, ví dụ protoplast mô thịt lá và trụ dưới lá mầm có thể phân biệt bằng màu sắc của diệp lục ở lá. Việc tách ra các sản phẩm dị nhân có thể tiến hành dưới kính hiển vi bằng micropipet.

2. Dựa vào phương pháp nhuộm huỳnh quang: trong phương pháp này, người ta nhuộm một trong hai dạng bố, mẹ với thuốc nhuộm huỳnh quang, chẳng hạn như rhodamin isothocyanate trước khi tiến hành dung hợp. Bằng kính hiển vi huỳnh quang soi nổi có thể phát hiện và chọn lọc các dòng tế bào dị nhân.

3. Dựa vào phương pháp kết hợp từ tính và gen chỉ thị kháng chất kháng sinh: trong phương pháp này, protoplast của dạng A được gắn với phân tử nhỏ có ái lực từ tính mạnh, protoplast của dạng B được gắn gen kháng chất kháng sinh (ví dụ kanamycine). Sau khi dung hợp, các protoplast được cho đi qua cột phân ly có từ tính mạnh, protoplast dạng A và dạng A + B được giữ lại cột, trong khi đó dạng B tách ra khỏi cột. Hỗn hợp protoplast lai A + B và A sau đó được nuôi trên môi trường chọn lọc (ví dụ có kanamycine) để tách ra dạng lai A + B.

4. Dựa trên các biểu hiện biến đổi di truyền, sử dụng các gen chỉ thị hoặc các gen đánh dấu: chẳng hạn như các gen đột biến gây bạch tạng, các đột biến hóa sinh thiếu hụt enzyme như nitrate reductase (NR), các gen đánh dấu có được nhờ phương pháp chuyển gen, các gen kháng chất kháng sinh hoặc kháng chất diệt cỏ...

 Ví dụ về các trường hợp sử dụng biểu hiện biến đổi di truyền như sau:

• Khi nuôi cấy các tế bào lai trong môi trường thiếu hormon ngoại sinh, các tế bào lai có khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây trong khi các tế bào bố mẹ không có khả năng đó (Power 1977, Shenck 1982).

• Cocking (1977) dung hợp protoplast giữa các dạng đột biến thuộc hai loài Petunia hybrid và Petunia parodii. Protoplast từ dạng đột biến bạch tạng của Petunia hybrid cho mô sẹo màu trắng, protoplast của Petunia parodii không cho mô sẹo, tế bào lai cho mô sẹo màu xanh.

 Ví dụ về việc sử dụng các gen chỉ thị hoặc các gen đánh dấu

• Masson (1989) và Thomas (1990) đã sử dụng phương pháp biến nạp gen chọn lọc cho cả hai dạng bố, mẹ: một dạng được gắn với gen kháng kanamycine, còn dạng kia được gắn với gen kháng hydromycine.

• Nếu một trong hai dạng bố mẹ là kiểu đột biến sinh dưỡng: ví dụ thiếu enzyme NR không thể sống trên môi trường NO3- do không chuyển hóa được NO3- → NO2- → NH3, còn dạng kia được chuyển gen kiểm soát một tính trạng trội (như gen kháng chất diệt cỏ, hoặc kháng chất kháng sinh) ta có thể chọn lọc các tế bào lai trực tiếp trên môi trường tối thiểu có bổ sung chất kháng sinh hoặc chất diệt cỏ. Phương pháp này đã được áp dụng ở cây thuốc lá và cải dầu.

5. Dựa trên các dấu chuẩn di truyền: gần đây, bằng các phương pháp phân tích các dấu chuẩn di truyền (RFLP, AFLP, RAPD...) người ta có thể xác định chính xác các con lai soma mang các gen của cả hai dạng bố, mẹ của nó, hay một phần gen từ một trong hai dạng bố hoặc mẹ có mặt trong tế bào lai.

11.9. Biến nạp di truyền.

 Các bước chính của biến nạp di truyền:

 Nhận biết gen thông qua chức năng sinh học (tính trạng liên quan đến đặc điểm hình thái, đặc điểm chức năng...). Xác định điều kiện đặc trưng cho quá trình biểu hiện và kĩm hãm gen.

 Gắn gen với các vector thông thường người ta sử dụng các loại plasmid mang gen kháng sinh để tiện lợi cho việc chọn lọc sản phẩm biến nạp sau này.

 Chuyển gen vào protoplast: có nhiều phương pháp chuyển gen: bằng hóa chất, xung điện, súng bắn gen, thông qua vi khuẩn Agrobacterium.

 Chọn sản phẩm biến nạp

 Đánh giá kết quả và theo dõi biểu hiện của gen biến nạp.

11.10. Chọn dòng tế bào

 Xử lý trực tiếp các tác nhân chọn lọc cho quần thể tế bào trần, chọn lọc các tế bào có khả năng chống chịu được với các tác nhân xử lý nhờ biến dị di truyền.

 Mỗi đĩa petri (đường kính 5-7 cm) có thể chứa tới 5.106 protoplast. Mỗi protoplast ứng với một cơ thể. Nếu để trồng hết số cơ thể thực vật trên phải dùng đến 100 ha đất. Trong không gian nhỏ hẹp đó ta phải xử lý đột biến protoplast rồi đưa chúng vào tình trạng stress để thanh lọc nhằm chọn ra các dòng có tính chống chịu với điều kiện bất thuận. Các tế bào sống sót trong các test thanh lọc sẽ được tái sinh thành cây để khảo sát tính chống chịu của chúng.

 Một số hệ thống chọn lọc:

• Chọn lọc dòng tế bào kháng sinh, các dòng tế bào kháng sâu bệnh, chịu thuốc trừ cỏ, chịu điều kiện bất thuận và các dòng tế bào có khả năng sinh trưởng trên các amino acid đặc thù trong số những acid amin khác.

• Chọn các dòng tế bào có khả năng sản xuất các hợp chất thứ cấp.

11.11. Một số tồn tại của kỹ thuật lai tế bào soma.

 Phần lớn các quy trình nuôi cấy tế bào trần là phức tạp, đòi hỏi cán bộ kỹ thuật có kỹ năng cao, đôi khi cần thiết bị đắt tiền.

 Đã thành công ở một số đối tượng cây trồng nhưng với nhiều loài cây trồng khác, việc tái sinh cây từ các tế bào trần còn gặp nhiều khó khăn, thậm chí không thể xảy ra.

 Tỷ lệ cây tái sinh bất thụ từ các tế bào soma trong nhiều trường hợp cao.

 Khả năng ứng dụng của lai soma vào lai xa còn hạn chế do có thất thoát nhiễm sắc thể của thể tái sinh đó.

 Ở nhiều loài cây trồng, cần phải tiếp tục cải tiến kỹ thuật nâng cao hiệu quả tái sinh của các tế bào trần sau khi dung hợp mới có thể đưa vào áp dụng thực tiễn.

12. Thụ phấn và nuôi cấy phôi invitro. Vì sao cần phải tiến hành kỹ thuật thụ phấn và nuôi cấy phôi hợp tử invitro. Điều kiện và các phương pháp tiến hành. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình.. và kỹ thuật thụ phấn nuôi cấy phôi invitro. Ví dụ minh họa.

13. Biến dị dòng vô tính là gì. Nêu các loại biến dị dòng vô tính. Nguyên nhân cơ chế gây nên biến dị đó. Đánh giá các khả năng biến dị của dòng vô tính và chiến lược sử dụng đột biến soma trong chọn giống cây trồng. Ví dụ

 Biến dị dòng soma (somaclonal variation) là khái niệm dùng để chỉ tất cả các biến dị thể hiện ở các tế bào, mô nuôi cấy và cây có nguồn gốc từ nuôi cấy mô (Larkin và Scowcrept, 1981). Biến dị dòng soma còn được gọi là biến dị dòng vô tính.

 Phân loại các biến dị dòng soma.

 Các biến dị kiểu gen

- Là các biến dị có khả năng di truyền, xảy ra với tỷ lệ rất thấp (10-5-10-7) và không có tính thuận nghịch. Chúng được chia làm ba nhóm chính:

• Các đột biến hệ gen: là các biến đổi về số lượng nhiễm sắc thể. Loại phổ biến là sự sai khác về số lượng nhiễm sắc thể như đa bội, dị bội, thể khảm. Các loài có độ bội cao và nhiều về số lượng nhiễm sắc thể rất dễ bị biến đổi hơn những loài có mức độ bội thể thấp và ít nhiễm sắc thể (Creissen and Karp, 1985).

• Các đột biến nhiễm sắc thể là các biến đổi về cấu trúc nhiễm sắc thể. Các thay đổi này có thể bao gồm các hiện tượng như mất đoạn, đảo đoạn, thêm đoạn hay nhân đoạn (tạo ra các nhiễm sắc thể lớn), chuyển đoạn và các biến đổi trong quá trình giảm phân.

• Các đột biến gen hay đột biến điểm là các biến đổi ở mức tế bào bao gồm: sự thay đổi của một cặp base, thay đổi về số lượng bản sao của một trình tự đặc thù, sự thay đổi trong biểu hiện của các nhóm đa gen hay sự biểu hiện của các gen nhảy (transposable elements).

 Biến dị kiểu hình (epigenetic variation).

- Không liên quan đến sự thay đổi về trình tự của ADN mà liên quan đến sự thay đổi trong quá trình thể hiện của một gen nhất định. Điển hình là các quá trình khuếch đại và methyl hóa gen.

- Các thay đổi về kiểu hình có thể là tạm thời, không có tính di truyền, có thể phục hồi trạng thái ban đầu và có tỷ lệ cao (10-3). Tuy nhiên chúng có thể duy trì trong suốt chu kỳ sống của cây tái sinh.

 Các nguyên chính gây biến dị dòng soma.

 Sự đa dạng di truyền tự nhiên của các tế bào nuôi cấy.

- Các mẫu cấy trên thực tế bao gồm nhiều loại tế bào khác nhau như là phloem, xylem, nhu mô, mô vỏ...những tế bào này có thể có mức độ bội thể khác nhau. Nói cách khác có sự đa dạng tế bào giữa các loại tế bào trong cùng một mẫu cấy. Sự đa dạng tế bào như vậy, thường gọi là polysomatic -đa bội vô tính). Các loài như lúa mỳ, thuốc lá đã được công bố là có các mức đa bội vô tính như thế.

- Nhiều thực vật tồn tại ở dạng thể khảm. Chúng chứa những lớp tế bào hoặc mô có cấu trúc di truyền khác nhau được phát triển từ meristem có chứa lớp hay bộ phận mô bị đột biến. Hiện tượng này đặc biệt phổ biến ở các cây thân gỗ.

 Tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy

- Loại và nồng độ chất điều tiết sinh trưởng sử dụng: Các mô nuôi cấy dài ngày trong môi trường chứa các auxin mạnh như 2,4 D hoặc 2,4,5 T thường gây ra các sai khác trong các cây tái sinh. Thí dụ các cây dừa dầu tái sinh từ callus nuôi cấy dài ngày trên môi trường có chứa 2,4 D có tỷ lệ rất lớn các biến dị khi trồng trên đồng, ở nho, các tế bào được nuôi cấy kéo dài trong vài năm đã mất dần khả năng phân hóa và tái sinh thành cây. Khi nuôi cấy tiểu mạch trên môi trường chứa 2mg/l 2,4,5 T làm tăng trao đổi chéo nhiễm sắc thể soma, nhưng khi bổ sung kinetin hiện tượng này giảm và nếu dùng 2,4 D thì không thấy hiện tượng này.

- Thời gian và số lần cấy chuyển: Việc nuôi cấy dài ngày trong điều kiện invitro cũng như tăng số lần cấy chuyển sẽ làm tăng khả năng xuất hiện các biến dị soma. Ví dụ trong nhân giống invitro chuối tiêu Nainco sau 5.7.9.11 lần cấy chuyển liên tiếp tỷ lệ biến dị soma là 1,3%.1,3%. 2,9% và 3.8% (Rodrigues và cộng sự, 1998).

- Loại mẫu cấy: Các loại mẫu cấy khác nhau thường thể hiện mức độ biến dị khác nhau. Các mẫu cấy có nguồn gốc từ các thể tiền chồi như chồi nách, chồi đỉnh hay meristem thường có mức độ biến dị thấp hơn khi sử dụng các mẫu có nguồn gốc không phải từ đỉnh sinh trưởng như: lá, rễ hay protoplast. Khả năng xảy ra các biến dị soma còn phụ thuộc vào kiểu gen cũng như tuổi cây. Các dòng già hơn thường tiềm ẩn các biến dị sẵn ở mức cao hơn ở các dòng trẻ.

- Phương thức nhân giống invitro: Các phương thức nhân giống khác sẽ cho tỷ lệ xuất hiện các biến dị vô tính khác nhau. Ví dụ: giống chuối tiêu "Grande Naine" tái sinh cây qua con đường tạo phôi vô tính có tỷ lệ biến dị soma 5.3% còn tái sinh qua con đường tiền chồi là 3.6%. Nhìn chung nếu chồi bất định được tái sinh từ một tế bào thì cơ hội để xuất hiện các biến dị soma thường là lớn hơn rất nhiều so với chồi được tái sinh từ nhiều tế bào. CÁc quá trình nuôi cấy tái sinh cây từ callus huyền phù hoặc protoplast do đó thường có nhiều loại biến dị soma.

 Cơ chế tạo biến dị soma.

- Sự thay đổi các kiểu methyl hóa bình thường của ADN genome: Quá trình methyl hóa là một quá trình mà một nucleotide cụ thể, thường là adenine hay cytosine có một nhóm methyl (-CH3) gắn liền với nó. Khi quá trình methyl hóa xảy ra như vậy một vùng ADN mã hóa cho một gen hoạt động, nó đã cản trở gen này và gen bị làm cho bất hoạt. Việc bất hoạt gen do quá trình methyl hóa có thể không được nhận biết về mặt hiện tượng mặc dù quá trình methyl hóa do nuôi cấy mô đã được tìm thấy trong một số loài như ngô, khoai tây và nho hiện tại chúng ta vẫn chưa biết tại sao quá trình này xảy ra.

- Sự sắp xếp lại nhiễm sắc thể: Sự mất, nhân đôi và tái tổ hợp vô tính là nguồn chính của các biến dị di truyền thể hiện ở các dòng soma. Ví dụ: khi nghiên cứu về cơ chế dẫn đến sự thay đổi trong nhiễm sắc thể, một số ý kiến cho rằng sự tái bản muộn của vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin) là nguyên nhân chính đã dẫn đến các biến dị dòng vô tính ở ngô (Zea maydis L.) và đậu lớn (vicia faba L.)

- Sự hoạt hóa các nhân tố chuyển vị (transposable element): Sự tách ra hay xen vào của các nhân tố này ảnh hưởng trực tiếp đến các gen cấu trúc ở gần nó. Hơn thế sự tách ra không chính xác của các nhân tố chuyển vị có thể tạo ra sự tai sắp xếp của các trình tự nucleotide phụ. Chúng là nguyên nhân của sự biến đổi trong biểu hiện gen cấu trúc nhiễm sắc thể. Các nhân tố chuyển vị như: ở ngô, Tnt2 ở cây thuốc lá...được hoạt hóa trong quá trình nuôi cấy mô.

- Đột biến điểm: Chúng có thể là đột biến lặn hay trội. Các đột biến gen đã được tìm thấy ở các cây cà chua (13 gen đơn khác nhau ở 230 cây tái sinh), lúa mỳ, thuốc lá, Arabidopsis thaliana ..

 Khả năng ứng dụng của chọn lọc biến dị dòng soma.

- Các hệ thống nuôi cấy tế bào giúp cho các nhà chọn tạo giống có môi trường được xác định rõ ràng, nơi mà áp lực chọn lọc có thể làm trên hàng ngàn các tế bào đơn và có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Như vậy, có thể chọn lọc từ lượng rất lớn các vật liệu di truyền đồng nhất về di truyền và xây dựng các thử nghiệm nhanh chóng trong một vài đĩa petri hay bình nuôi cấy.

- Có thể nghiên cứu một loài nhiệt đới ở vùng ôn đới hay ngược lại vì điều kiện môi trường đặc thù là có thể tạo ra ở bất cứ đâu.

Quy trình chọn các đột biến soma có ích ở cây cà chua ( Evan et als, 1984)

- Cây tái sinh R1 từ đĩa lá, chuyển ra đất, trồng đến khi thu quả

- Tự thự phấn thu cây thế hệ R2. Thu hoạch quả và gieo hạt sau khi xử lý nước nóng để phá ngủ.

- Theo dõi các chỉ tiêu hình thái của R2 trong quá trình trồng ra ruộng sản xuất theo từng lô thí nghiệm.

- Theo dõi các chỉ tiêu hình thái và quả thu hạt từ những lô thí nghiệm có xuất hiện các biến dị có ích.

- Chọn lọc từng cây từ R2, trồng tạo quần thể R3, xác định kiểu di truyền của các đặc tính có ích.

- Lai cây có tính trạng có ích với cây mang đột biến đã biết để xác định xem các đột biến đã có với các biến dị mới có cùng alen hay không.

- Nếu đột biến đã biết và biến dị mới không bổ sung, chúng là allelic, và biến dị mới xuất hiện được đánh dấu trên bản đồ. Nếu chúng bổ sung, tức khác vùng alen và như vậy được điều khiển bởi các gen khác. Các biến dị mới có thể lai với các dòng khác alen để xác định vị trí locus trên bản đồ.

- Các tính trạng là đột biến tế bào chất có thể được đánh giá về tính di truyền theo dòng mẹ bằng việc lai thuận nghịch giữa biến dị mới và dòng bố mẹ.

- Các cây được chọn lọc với các đặc tính có ích được thụ phấn và đánh giá cho đến khi thu dòng thuần.

- Hạt của các dòng được chọn lọc được tập hợp để công bố một giống mới.

 Chọn lọc biến dị soma.

 Tập trung chọn lọc

- Biến dị dòng soma chống chịu các stress sinh học (nấm, vi khuẩn, virus...)

- Biến dị dòng soma chống chịu với các stress phi sinh học (muối, kim loại nặng, hạn, lạnh...)

Một số ví dụ của biến dị soma di truyền trong chọn giống.

Cây trồng Đặc tính Sự di truyền Nguồn tài liệu

Thuốc lá 1. Chống chịu với độc tố methionine sulfoximin

2. Chống chịu với Pseudomonas syrigae

3. Màu lá

4. Đốm lá

5. Chống chịu nhôm

6. Chống chịu thuốc trừ cỏ Chlorosulfurin và Sulfometaron methyl S

S

S

S

S

S Carlson, 1973

Ngô Chống chịu Helmithosporum maydis chủng T Di truyền theo mẹ Gengenbach et al 1977

Cà chua 1. Chống chịu Helmithosproum

2. Màu quả

3. Chống chịu CMV S

S

S Evans et al, 1984

Evans and Sharp, 1983

Cassells et al, 1986

Lúa mỳ 1. Chống chịu stress hạn, nóng

2. Chống chịu mặn

3. Chống chịu Helmithosporum sativum S Sears et al, 1982

Lúa Chống chịu Xanthomonas oryzae S Ling et al

Bắp cải 1. Chống chịu Phoma ligam

2. Màu hạt

3. Chống chịu bệnh đốm mắt cua S

S

S Sacristan, 1982

George and Rao, 1983

Ramos Leal et al, 1996

Mía 1. Chống chịu với bệnh Fiji

2. Chống chịu Helminthosprorium sacchari VP

VP Krishna murthi & Tlaskal, 1974

Heinz et al, 1977

Larkin & Scowcroft, 1983

Khoai tây 1. Chống chịu Alternaria solani

2. Chống chịu Phytophthora infestans

3. Chống chịu Fusarium oxysporum VP

VP

Khoai lang 1. Màu sắc sẫm của vỏ củ S

Ghi chú: S: Di truyền hữu tính, VP: di truyền qua nhân giống vô tính

Hạn chế và triển vọng ứng dụng của các biến dị soma trong cải tiến giống cây trồng

Hạn chế Thuận lợi

 Không phải tất cả các đặc tính của cây trồng đều biến đổi

 Nhiều đặc điểm biến đổi không theo ý muốn.

 Không phải tất cả các biến dị đều làm xuất hiện các đặc tính mới

 Không phải tất cả các biến dị đều ổn định, bền vững.

 Vẫn cần đến đánh giá trên đồng ruộng  Các thay đổi có thể xảy ra ở các tính trạng nông học có ích

 Các thay đổi có thể xảy ra với tần xuất cao

 Một số biến dị cho kiểu hình mới mà không tạo được bằng công nghệ truyền thống

 Xác định các biến dị trong nuôi cấy mô

- Xác định qua kiểu hình

- Xác định bằng các biotest

- Phân tích ADN qua các chỉ thị phân tử.

14. Thế nào là nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật. Các đặc điểm. Các phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật. Các hướng ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào huyền phù thực vật. Lợi thế và đặc trưng của việc sản xuất các hợp chất thứ cấp bằng nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật trong bioreactor. Cho ví dụ minh họa

14.1.1 Khái niệm chung

 Caplin & Steward (1949) là những người đầu tiên công bố sự thành công của việc nuôi cấy các tế bào thực vật trong môi trường lỏng lắc. Sau đó các tác giả khác cũng đã lặp lại được các kết quả tương tự.

 Các nhà nghiên cứu ( Tulecke & Nickell, 1959) đã dự kiến trước sự sản xuất sinh khối lớn của tế bào thực vật bằng nuôi cấy chúng trong môi trường lỏng và khả năng sử dụng phương pháp này để sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của thực vật như alkaloid, steroit...

 Nuôi cấy huyền phù tế bào được khởi đầu bằng việc chuyển những mẫu mô sẹo (callus) xốp vào môi trường lỏng trong những bình nuôi có dung tích phù hợp (các bình Erlenmeyer dung tích 30-60 ml) và lắc nhẹ nhàng.

 Các tế bào được tách rời khỏi mô sẹo và phân tán trong môi trường lỏng. Ở đó chúng sinh trưởng, phân chia và có thể hình thành những cụm tế bào kết tập. Dung dịch nuôi cấy tế bào chuyển thành huyền phù tế bào.

 Huyền phù tế bào được duy trì bằng việc cấy chuyển định kỳ. Sau một số lần cấy chuyển độ phân tán của nó được tăng lên. Điều kiện quan trọng của nuôi cấy huyền phù là môi trường nuôi cấy được khuấy liên tục hoặc lắc, rung liên tục với tốc độ 100-150 vòng/phút.

 Các mô sẹo nuôi cấy trên môi trường chứa 2,4 D là nguồn nguyên liệu thích hợp để tạo huyền phù tế bào và để nhận 100ml huyền phù tế bào thường cần 2-3 g mô callus tươi.

14.1.2 Ứng dụng của nuôi cấy huyền phù tế bào.

 Sản xuất các hợp chất thứ cấp

 Các sản phẩm của tế bào thực vật có thể đơn giản như đường cho tới các hợp chất cao phân tử phức tạp như các chất thơm, chất nhuộm màu, dược liệu, chất trừ sâu.

 Sản phẩm của nuôi cấy huyền phù tế bào thường đặc trưng là những chất có giá trị cao và cần ở lượng nhỏ.

 Sử dụng trong công tác giống cây trồng

 Sử dụng để chọn lọc các dòng tế bào mong muốn qua các test thanh lọc. Sau đó tái sinh các tế bào đã chọn lọc được thành cây hoàn chỉnh để có thể thu nhận được các vật liệu khởi đầu quan trọng trong công tác chọn giống.

 Dùng để tách protoplast hoặc là nguồn để sản xuất các phôi vô tính.

14.1.3 Đặc điểm của nuôi cấy huyền phù tế bào.

14.1.3.1 Chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù

 Chu kỳ sinh trưởng của các tế bào huyền phù có dạng hình cong chữ S với các pha sinh trưởng sau:

• Pha tiềm sinh (lag phase) ở pha này không xảy ra sự tăng về khối lượng và số lượng tế bào (A).

• Pha số mũ (exponential phase) ở pha này sự phân chia và sự tăng khối lượng tế bào diễn ra với tốc độ lớn nhất. Ngoài ra sự sinh trưởng tế bào cũng tăng nhanh.

• Pha tuyến tính (linear phase) được đặc trưng bởi sự sinh trưởng của tế bào diễn ra ổn định liên tục (C).

• Pha ổn định ở pha này hoạt tính phân bào giảm mạnh, số lượng và khối lượng tế bào ổn định (stationary phase D)

• Pha suy thoái (dead phase) sự sinh trưởng của tế bào ra khỏi đỉnh cao, giảm xuống và dần đến ngừng sinh trưởng nếu không được cấy chuyển (E).

 Giai đoạn sinh trưởng log phase (pha số mũ) sẽ bị kéo dài nếu mật độ tế bào khi khởi đầu sự nuôi cấy là thấp. Mật độ ban đầu của huyền phù tế bào khi nuôi cấy thường là 0.5-2.5 105 tế bào/ml.

14.1.3.2 Môi trường nuôi cấy

 Về bản chất các tế bào huyền phù là loại tế bào callus, do đó môi trường nuôi cấy callus có thể sử dụng để khởi đầu việc nuôi cấy huyền phù tế bào với việc cải tiến hàm lượng và tỷ lệ auxin/cytokinin cho phù hợp để có được các tế bào phân tán tốt trong môi trường lỏng lắc.

 Huyền phù được duy trì bằng sự cấy chuyển liên tục ở đầu pha ổn định và ở thời điểm khi sự kết tập của tế bào là lớn nhất.

14.1.3.3 Các chỉ tiêu sinh trưởng

 Tổng số tế bào (mật độ tế bào)

 Khối lượng tươi của tế bào

 Khối lượng khô của tế bào

 Chỉ số phân bào (%) = Tổng số tế bào phân bào. 100/ Tổng số tế bào kiểm tra

 Khả năng sống của tế bào: nhuộm bằng fluorescein diacetae (0.01%) và quan sát thấy màu xanh dưới sự chiếu sáng tử ngoại (ultraviolet).

14.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong sản xuất các hợp chất thứ cấp.

14.2.1 Giới thiệu chung

 Hợp chất trao đổi thứ cấp của thực vật là những hợp chất có chức năng quan trọng trong đời sống thực vật và được sản xuất trong khi sinh tổng hợp những hợp chất trao đổi cơ sở như hydratcacbon, lipid, axit amin...

 Nuôi cấy tế bào và mô thực vật cho phép sản xuất các hợp chất trao đổi thứ cấp được thực hiện trong điều kiện invitro. Quá trình này dễ dàng được chuẩn hóa (không phụ thuộc vào các nhân tố phi sinh học như khí hậu, quang chu kỳ, nhiệt độ, mùa vụ...)

 Các hợp chất trao đổi thứ cấp của thực vật có thể được chia thành 4 nhóm trên cơ sở những hướng sử dụng cho đời sôns con người bao gồm:

• Hợp chất trao đổi thứ cấp của thực vật trong y học.

• Hợp chất trao đổi thứ cấp của thực vật trong nông nghiệp.

• Hợp chất trao đổi thứ cấp của thực vật trong công nghiệp thực phẩm

• Hợp chất trao đổi thứ cấp của thực vật trong mỹ phẩm

 Đa số các hợp chất trao đổi thứ cấp được sản xuất từ các nguyên liệu thực vật thu hái trong tự nhiên hay một số loài cây trồng. Quá trình này thể hiện một số bất lợi như:

• Tàn phá môi trường và sự xói mòn di truyền

• Sự cung cấp nguồn nguyên liệu không đều đặn, không vững chắc và chất lượng không ổn định của nguyên liệu thô

• Các thực vật có thể bị nhiễm bẩn bởi thuốc trừ sâu bệnh, hợp chất phóng xạ hay kim loại nặng khi chúng được thu hái từ những vùng bị nhiễm bẩn bởi các hợp chất này.

 Một số lợi thế của sản xuất các hợp chất trao đổi thứ cấp bằng phương pháp nuôi cấy tế bào:

• Có thể sản xuất các hợp chất thứ cấp theo yêu cầu với số lượng thấp hoặc với số lượng rất lớn mà những phương pháp công nghiệp và thương mại không thể sản xuất được.

• Có thể sản xuất nhiều hợp chất khác ngoài những hợp chất yêu cầu chính. Điều đáng lưu ý là điều kiện nuôi cấy biến đổi, các tế bào, mô nuôi cấy có thể biến đổi thế năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất bao gồm cả khả năng cảm ứng những hợp chất mới hoặc những hợp chất chưa biết.

• Có thể biến đổi những hợp chất trao đổi thứ cấp và những dẫn xuất của chúng trong quá trình sinh trưởng cảu tế bào thực vật. Điều đó dẫn tới sự chuyển đổi trong hoạt tính sinh học của các hợp chất.

14.2.2 Sản xuất các hợp chất thứ cấp bằng bioreactor

 Tulecke & Nickel là những người đầu tiên sử dụng bioreactor trong nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp.

 Trong phương pháp này các tế bào nuôi cấy không tái sinh thành cây hoàn chỉnh nhưng chúng tăng sinh khối và kết quả chúng sản sinh liên tục hợp chất trao đổi thứ cấp với số lượng lớn.

 Đến nay nhiều tác giả đã cố gắng cải tiến hệ thống nuôi cấy bioreactor cho tế bào của các loài thực vật khác nhau.

 Có hai lợi thế của nuôi cấy bioreactor là:

• Hệ thống nuôi cấy được thông khí hoặc trao đổi khí

• Môi trường nuôi cấy có thể dễ dàng thay mới từng thời kỳ

 Vì tế bào thực vật nhạy cảm với stress hơn vi khuẩn nên hệ thống bioreactor cho nuôi cấy tế bào thực vật thường xuyền cải thiện hệ thống thông khí và hệ thống trộn môi trường.

 Tế bào thực vật cần ánh sáng cho quang hợp nên cần có sự liên kết giữa bioreactor với hệ thống chiếu sáng.

So sánh giữa tế bào vi khuẩn và tế bào thực vật trong nuôi cấy huyền phù

Đặc điểm Vi khuẩn Tế bào thực vật

Kích thước Nhỏ Lớn

Đường kính (µm) 1-10 4-200

Diện tích bề mặt (µm2) 7-70 4500 (Colcus blumei)

Thể tích (µm3) 1-40 900000 (Colcus blumei)

Kiểu sinh trưởng Tế bào đơn Chủ yếu là cụm tế bào (5-1000 tế bào) có tế bào đơn và cả những tập hợp lớn

Sự sinh trưởng

Sự phân chia tế bào (giờ)

Tốc độ sinh trưởng (l/giờ) Nhanh

0.33 (E.coli)

2.10 (E.coli) Chậm

15-120

0.010-0.046

Sự nhạy cảm chống lại stress Thấp Cao hơn

Sự biến đổi di truyền Ổn định Lớn

Nơi tích lũy sản phẩm Ngoài tế bào Trong tế bào (không bào)

14.2.2.1 Đặc điểm của nuôi cấy huyền phù để sản xuất hợp chất trao đổi thứ cấp

 Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật nhằm mục đích sản xuất hợp chất trao đổi thứ cấp tương tự như nuôi cấy sinh khối vi sinh vật. Sự sai khác chỉ là một số đặc tính của tế bào nuôi cấy. Ví dụ: kích thước tế bào, sự sinh trưởng của tế bào và khả năng kết tập của tế bào.

14.2.2.2 Những phương pháp nuôi cấy và đồ thị của sự sinh trưởng của tế bào

 Nuôi cấy không liên tục

 Nguyên liệu thực vật được nuôi cấy trong hệ thống kín, cả môi trường nuôi cấy và tế bào thực vật không được chuyển đổi

 Phương pháp này yêu cầu phải cấy chuyển các tế bào thực vật sang môi trường tươi sau một chu kỳ.

 Đồ thì chu kỳ sinh trưởng của huyền phù tế bào khi nuôi cấy theo phương pháp này có các pha đặc trưng: pha tiềm sinh, pha số mũ, pha tuyến tính, phan ổn định, pha suy thoái.

 Nuôi cấy liên tục mở và khép kín

 Nuôi cấy liên tục là kỹ thuật trong đó môi trường nuôi cấy được cung cấp mới theo chu kỳ để tổng thể tích môi trường không đổi. Có nghĩa là thể tích của môi trường tươi được bổ sung tương đương với tổng số môi trường cũ đã bị dùng hết.

 Phụ thuộc vào việc các tế bào thực vật trung bình nuôi có được lấy ra hay không mà phân biệt 2 phương pháp sau:

• Nuôi cấy liên tục mở: tế bào thực vật được lấy ra đều đặn theo chu kỳ trong quá trình nuôi cấy. Trong nuôi cấy liên tục mở, sau pha tiềm sinh và pha logarit số lượng của tế bào thực vật được duy trì hằng định trong suốt phần còn lại của quá trình nuôi cấy.

• Nuôi cấy liên tục khép kín: tế bào thực vật không được lấy ra trong quá trình nuôi cấy, ở phương pháp nuôi cấy liên tục khép kín số lượng tế bào thực vật tăng lên liên tục ở pha logarit. Phương pháp này thường sử dụng khi cần sản xuất sinh khối tế bào. Ví dụ: trong sản xuất berberin từ những tế bào Berberis wiisonae.

 Nuôi cấy bán liên tục:

 Trong phương pháp nuôi cấy này sau một giai đoạn đều đặn cả tế bào và một phần môi trường được lấy ra khỏi hệ thống nuôi cấy. Sau đó một lượng môi trường tươi được bổ sung để tổng lượng môi trường vẫn giữ nguyên như ban đầu. Phần tế bào còn lại tiếp tục sinh trưởng và lại tăng số lượng.

 Lợi thế của phương pháp này là một phần sinh khối được tái sử dụng khi cấy chuyển.

 Sản xuất β-methyldigitoxin từ Digitalis lanata được thực hiện theo phương pháp này.

14.2.3 Sản xuất các chất trao đổi thứ cấp bằng nuôi cấy huyền phù tế bào.

14.2.3.1 Các hợp chất trao đổi thứ cấp trong y học

 Diosgenin:

 Việc nuôi cấy D. deltoidea trong bioreactor đã thu được năng suất Diosgenin cao hơn so với hiệu suất có được từ nguyên liệu tự nhiên. Trong nuôi cấy tế bào, diosgenin chiếm 7,8% khối lượng khô, trong khi đó tỷ lệ này chỉ đạt 2% đối với nguyên liệu thực vật thu hái tự nhiên (tính trung bình).

 Kết quả của nuôi cấy mô tế bào D. deltoidea để sản xuất diosgenin đã mở một triển vọng cho sản xuất steroit nguồn gốc thực vật khác invitro.

 Codein

 Papaver somniferum là nguồn của hai hợp chất rất quan trọng trong y học là morphine và codein. Morphin được dùng trong y học như là chất giảm đau quan trọng. Trong khi đó codein khi sử dụng một mình có hoạt tính chống ho. Tuy nhiên, codein thường được bổ sung với morphin để cải thiện thế năng chữa bệnh của morphine. Vì thế, trong thực tế nhu cầu của codein cao hơn so với morphine.

 Sản xuất morphine đã được thực hiện bằng việc nuôi cấy huyền phù tế bào Papaver somniferum.

 Chất chiết của nguyên liệu thực vật sau khi nuôi cấy cho thấy codein chiếm 1% khối lượng khô. Mặc dù rằng hiệu suất này không cao như mong muốn nhưng trong nuôi cấy tế bào Papaver somniferum codein đã được sản xuất nhiều hơn morphine, trong khi từ những thực vật thu hái hoang dại năng suất của morphine thường cao hơn codein.

14.2.3.2 Các chất trao đổi thứ cấp của thực vật trong nông nghiệp

 Nhìn chung, các chất trao đổi thứ cấp của thực vật sử dụng trong nông nghiệp một cách hạn chế. Có 3 hợp chất nguồn gốc từ thực vật được biết có tác dụng trừ sâu hại là pyrethrine từ cây cúc Chrysanthemum cineraifolium, rotenone từ Derris elliptica và nicotin từ cây thuốc lá Nicotiniana tabacum.

 Chúng ta biết rất ít về hiệu quả của nuôi cấy tế bào Ch. Cinerafolium trong sản xuất pyrethine và nuôi cấy rễ cây Derris elliptica để thu rotenone.

 Nicotine có thể sản xuất bằng nuôi cấy huyền phù tế bào thuốc lá Nicotinana tabacum với hiệu suất đạt 2,2%. Tuy nhiên, vì nicotine không được sử dụng rộng rãi làm chất trừ sâu nên kỹ thuật này trong thực tế không được áp dụng.

14.2.3.3 Hợp chất thứ cấp của thực vật trong công nghiệp thực phẩm.

 Đa số các hợp chất thu hái từ thực vật được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm như các gia vị và chất tạo màu thực phẩm. Các chất mùa thực phẩm và gia vị tự nhiên ngày càng được sử dụng nhiều hơn.

 Betalaine

 Betalaine là một nhóm các chất màu thực phẩm, bao gồm betaxathine (màu vàng) và betacyane (màu đỏ). Betacyane có thể thu được từ các cây Besella alba var. rubra (Basellaceae), Beta vulgaris var. rubra và Chemopodium rubrum (cả hai đều thuộc họ Chenopodiaceae) Phytolacca amerricana (Phytolaccaceae) và Portulaca grandiflora (Portulaceae).

 Đã có nhiều công bố về sản xuất betacyane bằng nuôi cấy tế bào thực vật. Ví dụ: như nuôi cấy cơ quan cây Beta vulgaris var. rubrea (Constabel, 1967), nuôi cấy callus và huyền phù tế bào của Phytolacca americana (Cynnel, 1989).

 Steviol

 Steviol là chất tạo vị ngọt được biết rộng rãi, thu nhận được từ cây Stevia rebaudiana. Chất này ngọt gấp 300 lần so với đường mía và được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm

 Từ năm 1970, đã có một số cố gắng để thiết lập việc nuôi cấy mô tế bào Stevia rebaudiana cũng như nhân giống vô tính một số dòng có năng suất steviol cao hoặc có tích lũy steviol trong nuôi cấy huyền phù tế bào và callus.

 Nuôi cấy callus là giai đoạn tiền đề để nuôi cấy huyền phù tế bào trong tích lũy steviol. Trong nuôi cấy callus hiệu suất của steviol có thể đạt tới 36,4% trong lượng khô. Tuy nhiên, có lẽ vì lý do kinh tế nên kỹ thuật này không được áp dụng rộng rãi ở mức độ thương mại.

14.2.3.4 Các chất trao đổi thứ cấp của thực vật trong công nghiệp mỹ phẩm

 Trong công nghiệp mỹ phẩm có 2 loại chất trao đổi thứ cấp của thực vật được quan tâm nhất là chất màu và chất thơm. Vì các hợp chất thơm, do cấu trúc phức tạp của các este, chúng được sản xuất bằng nuôi cấy mô, với số lượng thấp.

 Shikonin là chất màu đã được sản xuất thương mại bằng nuôi cấy mô. Shikomin là chất chiết từ rễ của các loài Boraginaceae như: Lithospermum erythrorhizon. Nó có hoạt tính kháng sinh và đã được dùng trong y học cổ truyền của Nhật từ lâu. Shikonin có màu đỏ huyết dụ do đó được dùng trong công nghiệp mỹ phẩm, đặc biệt trong sản xuất so môi ở Nhật Bản.

 Shikonin được sản xuất công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào bằng hệ thống bioreactor với 2 giai đoạn nuôi cấy: trong giai đoạn 1, tế bào thực vật được sinh trưởng trong bioreactor 200lit để tăng trưởng lượng tế bào. Giai đoạn 2 chúng được chuyển sang bioreactor 750 lít để sản xuất shikonin. Tính toán về hiệu quả kinh tế cho thấy phương pháp mới lợi hơn phương pháp cũ 800 lần.

Hoạt chất Chỉ định điều trị Loài thực vật

1. Steroit của Diosgenin ức chế sự rụng trứng chuẩn bị cortison Dioscorea delloidca

2. Codeine Giảm đau Papaver somniferum

3. Atropine Chống tác động của choline Atropa helladonna

4. Reserpine Chống tăng trương cơ Rawwolfia serpentian

5. Hyoscyanine Chống tác động choline Hyoscyamus niger

6. Digoxine Kích thích tim Digitalis lanata

7. Scopolamine Chống tác động choline Dautuara metel

8. Digitoxine Kích thích tim Digital lanata

9. Pilocarpine Tác động choline Pilocarpus jaborandi

10. Quinine Chống sốt rét Cinchona ledgeriana

Sản xuất các hợp chất trao đổi thứ cấp bằng nuôi cấy huyền phù tế bào

Sản phẩm Loài Năng suất (% chất khô) Nguồn tài liệu tham khảo

Diosgenin Dioseorea deltoidea

Codein Papaver somniferum

Hyoscyamine Anisodus acutangulus

Scopolamine Rawwolfia serpentina

Kesepin Catharanthus roseus

Serpentine

Protoberberin

Anthrachinom

Rosmarin

Nicotine

Shikonin

14.2.4 Tính kinh tế của việc nuôi cấy tế bào thực vật ở phạm vi lớn.

 Điều đã được khẳng định là để nghiên cứu phát triển sản xuất thương mại một sản phẩm yêu cầu 10 năm đầu tư

 Sự đầu tư này cần phải được bù lại và điều đó chỉ thực hiện được khi thị trường của sản phẩm tạo ra có doanh số hàng năm là 50 triệu USD và giá bán thấp nhất là 400-500USD/kg.

 Thực tế không có nhiều sản phẩm thỏa mãn được yêu cầu này. Ví dụ jacmin và ajmalicine có giá bán rất đắt (5000USD/kg jacmin và 1500USD/kg ajmalicine) nhưng doanh số tromg một năm chỉ đạt 500000USD cho jacmin và 5 triệu USD cho ajmalicine, spermine có doanh số /năm đạt 100 triệu USD nhưng giá bán lại chỉ có 30 USD/kg.

 Trong tương lai sự nghiên cứu cần tập trung trực tiếp vào những sản phẩm mới mà chúng có khả năng mở ra thị trường mới và có giá của quy trình sản xuất rẻ hơn.

15. Đặc điểm và ưu thế của kỹ thuật bảo quản nguồn gen tế bào thực vật invitro. Nguyên lý và cách tiến hành bảo quản nguồn gen tế bào thực vật invitro?