Câu 1: Định nghĩa và đối tượng miễn dịch thực vật. Kể 2 sự kiện liên quan đến lịch sử miễn dịch thực vật?

1        Miễn dịch: Immunity là một thuật ngữ y học mô tả trạng thái có đủ sự phòng thủ sinh học nhằm chống lại sự nhiễm bệnh hay sự tấn công của các tác nhân sinh học. Tương tự như vậy, đối với thực vật thì miễn dịch có thể hiểu là khả năng của cây duy trì sự không bị bệnh trước sự tấn công của các tác nhân sinh học.

2        Các tác nhân sinh học ở đây bao gồm: Các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn), virus, tuyến trùng, côn trùng (đặc biệt là nhóm côn trùng chích hút) và các tác nhân do môi trường bất lợi.

à Định nghĩa: Miễn dịch trong môn học miễn dịch thực vật cần được hiểu rộng là khả năng của cây chống lại ở mọi mức độ của sự tấn công của các tác nhân gây bệnh nhờ các đặc điểm cấu trúc và di truyền. Theo định nghĩa này, miễn dịch có thể hiểu là tính kháng của cây với các tác nhân gây bệnh.

1        Đối tượng của miễn dịch thực vật: nghiên cứu sự tương tác giữa tác nhân gây bệnh và cây ký chủ trong quá trình gây bệnh nhằm hiểu và ứng dụng khả năng kháng bệnh của cây.

2        Hai sự kiện liên quan đến lịch sử miễn dịch thực vật:

o Năm 1894, Ericksson đã phát hiện ra nấm gỉ sắt trên thân cây cốc (Puccinia graminis) gồm các chủng sinh lý không thể phân biệt nhau về mặt hình thái (giống nhau cả về hình thái nấm (bào tử) và triệu chứng - dấu hiệu bệnh) nhưng lại khác nhau về tính gây bệnh trên cây ký chủ, hiện nay đã phân lập được ra các chủng đó là:

§ Puccinia graminis f.sp. tritici gây hại lúa mỳ.

§ Puccinia graminis f.sp. avenae gây hại đại mạch.

§ Puccinia graminis f.sp. secalis gây hại tiểu mạch.

o Năm 1902 Ward, và năm 1915 Stakman, khi nghiên cứu bệnh gỉ sắt trên cây lúa mỳ đã ghi nhận phản ứng chết hoại rất nhanh trên mô lúa mỳ do nấm và gọi phản ứng này là phản ứng siêu nhạy (hypersensitive response).

o Năm 1905, Biffen cho biết tính kháng bệnh gỉ sắt của 2 giống lúa mỳ Michigan Bronze (S) và Rivet (R) di truyền theo quy luật của Mendel (F1: 100% S, F2 - 3 S/1 R).

o Năm 1909, Orton khi nghiên cứu bệnh héo Fusarium (Fusarium oxysporum) trên cây bông, dưa hấu và đậu đã phân biệt các khái niệm kháng bệnh (resistance), thoát bệnh (escape) và chịu bệnh (tolerance).

o Năm 1914, Stakman và đồng nghiệp đã giải thích:

§ Một giống cây kháng bệnh ở vùng này nhưng có thể nhiễm bệnh tại vùng khác.

§ Tính kháng bệnh thay đổi từ năm này sang năm khác.

§ Lý do các giống kháng trở nên nhiễm bệnh bất thình lình.

à Tất cả đều do sự có mặt hay sự thay đổi thành phần chủng sinh lý của các tác nhân gây bệnh.

o Năm 1964, Klement và đồng nghiệp ghi nhận phản ứng siêu nhạy cũng xảy ra ở cây bị vi khuẩn tấn công. Năm 1972, phản ứng siêu nhạy cũng được ghi nhận trên động vật và gọi là apoptosis.

o Năm 1940-1965 Harol Flor, một nhà bệnh cây học người Mỹ, khi nghiên cứu bệnh gỉ sắt trên cây lanh (Melamspora lini) đã đưa ra thuyết gen đối gen. For each gene that conditions resistance in the host there is a corresponding gene that conditions pathogenicity in the parasites - đối với mỗi gen quy định tính kháng trên cây ký chủ thì có một gen tương ứng quy định tính gây bệnh trong ký sinh.

o Năm 1963, Vanderplank cho biết có 2 loại tính kháng:

§ Tính kháng dọc (vertical resistance) được điều khiển bởi một hoặc một vài gen kháng chủ "major" resistance gene có tính kháng cao, nhưng chỉ chống được một hoặc một vài chủng tác nhân gây bệnh.

§ Tính kháng ngang (horizontal resistance) được điều khiển bởi nhiều gen kháng thứ "minor" resistance gene có tính kháng yếu nhưng kháng được tất cả các chủng sinh lý.

Câu 2: So sánh miễn dịch thực vật và miễn dịch động vật. Định nghĩa 2 loại tính kháng bệnh và tính chịu bệnh?

1        So sánh miễn dịch thực vật và miễn dịch động vật:

o Giống nhau:

§ Ở mức độ phân tử và tế bào: phản ứng phòng thủ của thực vật và động vật chia sẻ nhiều điểm chung mà quan trọng nhất là quá trình nhận biết và khởi động phản ứng kháng hay miễn dịch.

§ Các tế bào đều có khả năng nhận biết được các tác nhân vi sinh vật ngoại lai là do các tác nhân vi sinh vật đều hình thành các phân tử gọi là mô hình phân tử MAMP/PAMP. Và các MAMP/PAMP này khá bảo thủ.

-     MAMP: Microbe associated molercular pattern

-     PAMP: Pathogen associated molercular pattern

à Một số ví dụ như: LPS (Lipopolysaccharide) ở vi khuẩn Gram (-); Peptidoglycan của vi khuẩn Gram (+); Flagellin của lông roi vi khuẩn; Chitin, glucan của vách tế bào nấm; Các Avr Protein (Avirulence) của các tác nhân gây bệnh cây.

§ Các receptor nhận biết các MAMP/PAMP khá giống nhau ở động vật và thực vật, ký hiệu là PRR - Pattern Recognition Receptor.

-     PRR của động vật là các protein như Toll của ruồi giấm hay Toll Like Receptor (TLR) của động vật máu nóng.

-     PRR của thực vật là các protein kháng (Protein R) như FLS2, Cf9 hay Xa21...

-     Các PRR này đều có các đặc điểm chung như:

·    Về đặc điểm cấu trúc:

ü Đều có vùng lặp giàu Leucine ở đầu C (gọi là vùng LRR - Leucine Rich Repeats) - là vùng nhận biết các MAMP/PAMP.

ü Và vùng TIR - Toll_Interleukin 1 Receptor ở đầu N

·    Về đặc điểm chức năng: nhận biết các MAMP/PAMP và khởi động phản ứng miễn dịch/kháng kháng bẩm sinh.

o Khác nhau: Động vật máu nóng có hệ miễn dịch còn thực vật thì không có. Hệ miễn dịch bao gồm các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch và các tế bào có thẩm quyền miễn dịch.

§ Các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch như tuyến ức, lách, tủy... là nơi sản sinh, duy trì, biệt hóa và điều khiển hoạt động của các tế bào có thẩm quyền miễn dịch.

§ Các tế bào có thẩm quyền miễn dịch chủ yếu là lympho bào B và lympho bào T tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch của cơ thể nhằm chống lại các tác nhân lạ xâm nhập vào cơ thể. Có hai kiểu đáp ứng miễn dịch như sau:

-     Kiểu đáp ứng miễn dịch dịch thể:

·    Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể sẽ lập tức bị đại thực bào vây bắt, xử lý và trình diện cho lympho bào T.

·    Lympho bào T được biến đổi trở thành trợ bào T.

·    Trợ bào T giúp biến đổi lympho bào B thành tế bào plasma sản xuất ra kháng thể dịch thể Ig (Immuno globulin) bao gồm 5 lớp là IgG, IgA, IgM, IgE, IgD.

·    Các kháng thể dịch thể tồn tại trong dịch cơ thể (huyết tương) và kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên,

·    Một số ít trường hợp, kháng nguyên có thể kích thích trực tiếp lympho bào B thành tế bào plasma

-     Kiểu đáp ứng miễn dịch tế bào:

·    Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể bị đại thực bào vây bắt, xử lý và trình diện cho lympho bào T.

·    Lympho bào T được biệt hóa thành lympho bào T mẫn cảm với kháng nguyên và chính bản thân chúng là kháng thể tế bào.

2        Định nghĩa 2 loại tính kháng bệnh và tính chịu bệnh:

o Tính kháng bệnh (resistance): Là khả năng của cây loại bỏ hoặc khắc phục hoàn toàn, hoặc ở mức độ nào đó ảnh hưởng của tác nhân gây bệnh hoặc của các yếu tố gây hại.

§ Tính kháng ký chủ:

-     Tính kháng không đặc hiệu chủng: tính kháng ngang, số lượng, gen thứ, đa gen, đồng ruộng à tính kháng được điều khiển bởi nhiều gen có ảnh hưởng nhỏ đến tính kháng, có tính kháng yếu nhưng kháng được hầu hết các kiểu gen của một tác nhân gây bệnh. Kiểu gen của cây ký chủ biến động liên tục biểu hiện tính kháng từ rất nhẹ đến khá kháng. Và tính kháng này được biểu hiện tốt nhất trên đồng ruộng.

-     Tính kháng đặc hiệu chủng: tính kháng dọc, chất lượng, gen chủ, đơn gen à được điều khiển bởi một hoặc một vài gen có ảnh hưởng lớn đến sự biểu hiện tính kháng, có tính kháng cao nhưng chỉ kháng được một số kiểu gen (chủng, nòi) của tác nhân gây bệnh. Kiểu gen của cây ký chủ có thể dễ dàng phân biệt giữa dạng kháng và dạng mẫn cảm

§ Tính kháng phi ký chủ: còn gọi là tính kháng cơ bản, tác nhân gây bệnh và cây ký chủ tương tác không tương hợp với nhau

§ Ngoài ra còn một vài khái niệm tính kháng khác như:

-     Tính kháng bẩm sinh: là một dạng tính kháng do tiềm năng di truyền qui định.

-     Tính kháng tạo được: là dạng tính kháng hình thành hoặc cục bộ hoặc hệ thống trên cây ký chủ mẫn cảm khi bị kích thích bởi tác nhân gây bệnh hoặc các yếu tố vô sinh.

-     Tính kháng cả đời: biểu hiện tính kháng ở tất cả giai đoạn của cây.

-     Tính kháng mô trưởng thành: ở một số loài mô già hoàn toàn kháng bệnh

-     Tính kháng cây trưởng thành: biểu hiện kháng khi cây trưởng thành (do gen chủ đặc hiệu chủng điều khiển).

-     Tính kháng bền vững: duy trì trong thời gian lâu dài dưới tác động của tác nhân gây bệnh.

-     Tính kháng ổn định: biểu hiện ở nhiều điệu kiện sinh trưởng khác nhau.

-     Tính kháng biểu kiến: trong nhiều trường hợp tương tác giữa cây ký chủ và tác nhân gây bệnh tương hợp nhau (thậm chí cấy ký chủ rất mẫn cảm) nhưng cây có thể không bị nhiễm bệnh, hoặc có nhiễm bệnh nhưng không biểu hiện triệu chứng hoặc triệu chứng không đáng kể

o Tính chịu bệnh: là một thành phần trong tính kháng biểu kiến à tính chịu bệnh chính là khả năng của cây bị nhiễm bệnh nhưng không bị ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng và sinh sản, đặc biệt là trong trường hợp này cây không biểu hiện bất kỳ phản ứng kháng bệnh nào.

Câu 3: Nêu đặc điểm xâm nhập của nấm, vi khuẩn và virus vào trong cây. Đặc điểm dinh dưỡng gây bệnh của mỗi nhóm?

3        Đặc điểm xâm nhập và dinh dưỡng gây bệnh của nấm:

o Đặc điểm chung của nấm gây bệnh:

§ Trên 80% số bệnh hại cây trồng là do nấm bệnh gây ra.

§ Phần lớn nấm có cơ quan sinh trưởng là sợi nấm có cấu tạo dạng sợi, hợp thành một tản nấm.

§ Sợi nấm đa bào hoặc đơn bào, phân nhánh.

§ Không có diệp lục, dị dưỡng.

§ Sinh sản tạo ra bào tử.

§ Tế bào sợi nấm có vách tế bào (glucan, chitin), nhân. Tế bào chất có không bào và các bào quan.

o Đặc điểm xâm nhập của nấm:

§ Nấm có thể xâm nhập vào cây bằng sợi nấm hay bào tử, phần lớn nấm xâm nhập vào cây bằng bào tử. Trước khi xâm nhập bào tử phải tiếp xúc với bề mặt ký chủ, gặp điều kiện thuận lợi (nhiệt độ, độ ẩm) bào tử nấm nảy mầm thành ống mầm. Tùy từng lại nấm mà nấm có thể xâm nhập vào bên trong cây trực tiếp hoặc gián tiếp.

-     Xâm nhập trực tiếp (chủ động):

·    Bào tử của một số loại nấm, ví dụ bào tử động Phytophthora, Plasmodiophora brassicae nảy mầm thành ống mầm xâm nhập trực tiếp qua bề mặt rễ.

·    Bào tử một số loại nấm, ví dụ bào tử phân sinh nấm Alternaria nảy mầm thành ống mầm xâm nhập trực tiếp qua tầng cutin của lá.

à Trong qua trình xâm nhập trực tiếp, nấm luôn tiết ra enzyme để làm mềm bề mặt và tạo điều kiện thuận lợi cho sự nảy mầm.

1        Đối với một số loại nấm, ví dụ Pyricularia oryzae, Colletotrichum, Oidium bào tử nảy mầm thành ống mầm. Đầu ống mầm hình thành một cấu trúc đặc biệt gọi là giác bám hay còn gọi là vòi bám/vòi áp/đĩa áp (appressorium). Trên giác bám hình thành đế xâm nhập hay còn gọi là vòi xâm nhập/móc xâm nhập (penetration peg) đâm xuyên qua bề mặt ký chủ gồm tầng cutin và vách tế bào. Giác bám tích lũy nhiều carbonhydrate (chủ yếu là glycerol) à tạo áp lực thẩm thấu cao, giúp hút nước từ bên ngoài vào trong giác bám, tạo một áp suất trương lớn (như giác bám của nấm phấn trắng tạo áp suất trương khoảng 20-40atm, của Pyricularia oryzae khoảng 80atm, trong khi của lốp xe ô tô chỉ khoảng 2-3atm). Áp suất trương cao cho phép nấm xâm nhập qua bề mặt ký chủ bằng đế xâm nhập dễ dàng. Mặc dù sự xâm nhập bằng giác bám và đế xâm nhập là do lực cơ học nhưng nấm cũng tiết ra các enzyme nhằm hỗ trợ cho sự xâm nhập như cellulose, pectinase. Trong nhiều trường hợp, ví dụ nấm đạo ôn, sự xâm nhập chỉ có thể xảy ra nếu giác bám tích lũy sắc tố đen (melanin). Melanin sẽ làm cho vách giác bám vững chắc, không bị vỡ khi giác bám hút nước để tạo áp suất trương lớn.

-     Xâm nhập gián tiếp (thụ động):

2        Qua lỗ mở tự nhiên: một số loại nấm sẽ xâm nhập vào cây qua lỗ mở tự nhiên như khí khổng, thủy khổng, bì khổng. Ví dụ bào tử nấm Cercospora, bào tử nấm gỉ sắt, nảy mầm thành ống mầm và xâm nhập vào cây qua khí khổng.

3        Qua các vết thương cơ giới, các vết nứt tự nhiên: Một số loại nấm có thể xâm nhập qua các tổn thương cơ giới hoặc các vết nứt tự nhiên. Ví dụ bào tử nấm Fusarium oxysporum nảy mầm thành ống mầm và xâm nhập qua vết nứt hình thành khi rễ bên nhú ra từ rễ chính.

* Chú ý: Nhiều loại nấm có thể xâm nhập vào cây theo cả hai hình thức chủ động và thụ động.

o Dinh dưỡng gây bệnh của nấm:

§ Nhóm tạo vòi hút: để hấp thụ dinh dưỡng, nhiều loài, chủ yếu thuộc nhóm sinh dưỡng bắt buộc (obligate biotroph) như sương mai, gỉ sắt, phấn trắng hoặc một số loài thuộc nhóm bán sinh dưỡng (semi-biotroph) như Pyricularia oryzae, Pseudomonas syringae tạo ra cấu trúc gọi là vòi hút (haustorium) bên trong tế bào ký chủ để hấp thụ dinh dưỡng. Các nấm thuộc nhóm sinh dưỡng thường không giết chết tế bào, còn các nấm thuộc nhóm bán sinh dưỡng thì giết chết tế bào về sau

§ Nhóm không tạo vòi hút: Các nhóm nấm hoại dưỡng (necrotroph) như Rhizoctonia, Sclerotium thường không tạo thành vòi hút mà ngay trong quá trình xâm nhập, chúng tiến hành phân hủy tế bào và mô ký chủ bằng enzyme và độc tố.

4        Đặc điểm xâm nhập và dinh dưỡng gây bệnh của vi khuẩn:

o Đặc điểm xâm nhập của vi khuẩn:

§ Mặc dù vi khẩn có khả năng di chuyển bằng lông roi trong màng nước, nhưng do không có khả năng tự xuyên thủng bề mặt nguyên vẹn của ký chủ nên phần lớn vi khuẩn xâm nhập vào cây hoàn toàn thụ động qua các lỗ mở tự nhiên như khí khổng, thủy khổng, bì khổng hoặc qua các vết thương cơ giới trên lá, rễ. Trên lá, điều kiện màng nước là hoàn toàn cần thiết để giúp vi khuẩn có thể di chuyển tới lỗ mở.

§ Một số vi khuẩn lan truyền nhờ vector sẽ xâm nhập vào cây nhờ vector như vi khuẩn Erwinia tracheiphila xâm nhập nhờ bọ cánh cứng Acalymma vittata.

§ Một số loài vi khuẩn biệt dưỡng cũng xâm nhập vào cây nhờ vector như Candidatus liberobacter asiaticus xâm nhập vào cây nhờ rầy chống cánh Diaphorina citri.

o Dinh dưỡng gây bệnh của vi khuẩn: Sau khi xâm nhập vào trong mô vi khuẩn không hình thành bất cứ một cấu trúc đặc biệt nào để hấp thụ dinh dưỡng. Do vậy, vi khuẩn sẽ sử dụng các enzyme và độc tố để phân hủy tế bào ký chủ và vật chất hữu cơ để hấp thụ qua màng tế bào, ngoài ra việc tiết ra các enzyme và độc tố còn có tác dụng giúp vi khuẩn khắc phục tính kháng của cây ký chủ.

5        Đặc điểm xâm nhập và dinh dưỡng gây bệnh của virus:

o Đặc điểm xâm nhập của virus: mặc dù nhiều loài virus có thể xâm nhập vào cây nhờ tổn thương cơ giới (thí dụ có thể sử dụng bột carbonduraan thổi lên bề mặt lá sau đó lấy dung dịch chứa virus bôi lên bề mặt lá và cọ sát nhẹ lớp bột sẽ tạo ra vết thương cơ giới) thì ngoài tự nhiên hầu hết virus xâm nhập vào cây nhờ vector (môi giới truyền bệnh chích nạp trực tiếp virus từ cây bệnh sang cây khỏe mạnh).

o Dinh dưỡng gây bệnh của virus: Virus có hình thức dinh dưỡng đặc biệt hơn so với nấm và vi khuẩn. Vì số lượng gen mã hóa bởi virus rất ít nên quá trình tái sinh virus phụ thuộc vào vật liệu (amino acid, nucleotide), bộ máy tổng hợp acid nucleotide, năng lượng (chủ yếu dưới dạng các hợp chất cao năng như ATP), bộ máy dịch mã (ribosome, tRNA, các enzyme liên quan) của tế bào ký chủ. Cần chú ý là ngoài sự dụng tài nguyên của tế bào ký chủ thì quan trọng hơn, virus gây bệnh cây nhờ tương tác giữa protein virus (mặc dù ít) với các chất chịu trách nhiệm cho chức năng sinh lý của tế bào ký chủ.

§ Như Protein replicase của virus TMV (Tobacco mosaic virus) tương tác với protein Aux/IAA của tế bào ký chủ chịu trách nhiệm điều hòa các phản ứng sinh hóa qua đường hướng dẫn truyền auxin.

§ Protein Rep của geminivirus tương tác với protein tương tự Retinoblastoma (pRBR) của tế bào ký chủ, chịu trách nhiệm điều khiển chu kỳ tế bào.

Câu 4: Đặc điểm độc tố của tác nhân gây bệnh. Khái niệm độc tố chọn lọc ký chủ và độc tố không chọn lọc ký chủ. Mô tả đặc điểm của một loại độc tố chọn lọc ký chủ và một loại độc tố không chọn lọc ký chủ?

1        Đặc điểm độc tố của tác nhân gây bệnh (chủ yếu là của nấm và vi khuẩn): trong quá trình gây bệnh, tác nhân gây bệnh có thể tiết ra một số chất gây độc cho tế bào và mô ký chủ gọi là độc tố. Độc tố có một số đặc điểm sau:

§ Không có bản chất enzyme nhưng đa dạng về thành phần và cấu trúc hóa học.

§ Tác động lên tế bào ở nồng độ rất thấp.

§ Thường do tác nhân gây bệnh tổng hợp trên cây, nhưng cũng có thể tổng hợp trên môi trường nhân tạo.

§ Tác động lên nhiều chức năng sinh lý của tế bào, chủ yếu thong qua sự tương tác với các enzyme chức năng của tế bào.

§ Độc tố có thể đóng vai trò như tác nhân qui định tính độc (còn gọi là yếu tố độc) tác động phụ thuộc số lượng và làm thay đổi triệu chứng. Độc tố cũng có thể đóng vai trò như tác nhân qui định tính gây bệnh (còn gọi là yếu tố gây bệnh) tác động phụ thuộc chất lượng (có nghĩa phụ thuộc sự có mặt hay không có mặt của độc tố).

§ Phần lớn là nấm và vi khuẩn thuộc nhóm hoại dưỡng (necrotroph), một số cũng gây hại cho động vật.

§ Chức năng: Giết chết tế bào để (1) giải phóng dinh dưỡng cần cho tác nhân gây bệnh hoặc (2) ngăn cản tế bào thực hiện các phản ứng phòng thủ.

Trong bệnh cây độc tố của tác nhân gây bệnh chia làm hai nhóm chính là:

1        Độc tố không chọn lọc ký chủ (nonhost-selective or nonhost-specific toxin)

§ Là loại độc tố không chỉ tác động lên loài cây ký chủ của tác nhân gây bệnh mà còn tác động lên nhiều loài cây khác không phải ký chủ của tác nhân gây bệnh à tác động không chọn lọc.

§ Thường là yếu tố độc nghĩa là làm tăng tính độc của tác nhân gây bệnh (tăng mức độ biểu hiện của triệu chứng).

§ Về cơ chế tác động: một số độc tố (vd: tabtoxin, phaseolotoxin) ức chế enzyme của tế bào ký chủ dẫn tới sự tích lũy các chất tới mức gây đầu độc tế bào hoặc làm thiếu hụt nghiêm trọng các chất cần thiết cho tế bào.

§ Ví dụ:

o Tabtoxin: do vi khuẩn Pseudomonas syringae pv.tabaci gây bệnh đốm cháy thuốc lá (wildfire). Một số chủng (gọi là các chủng tạo độc tố) của vi khuẩn này tạo vết đốm với quầng vàng trên thuốc lá. Dịch lọc vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường nhân tạo hoặc độc tố tinh chiết ra cũng biểu hiện triệu chứng tương tự không chỉ trên cây thuốc lá mà còn trên nhiều loài cây thuộc nhiều họ thực vật khác nhau. Một số chủng bị đột biến mất khả năng tạo tabtoxin (ký hiệu là chủng Tox -) có tính độc giảm và tạo ra vết đốm chết hoại và không có quầng vàng. Tabtoxin là một dipeptide gồm 2 amino acid (threonin và tabtoxinin). Bản thân tabtoxin không độc nhưng ở trong tế bào, tabtoxin bị thủy phân thành tabtoxinin và threonin. Tabtoxin là một chất độc vì nó làm bất hoạt "Glutamine synthetase" (enzyme cần thiết cho sự tổng hợp glutamine từ glutamate và NH3) à dẫn tới suy giảm nghiêm trọng lượng glutamine trong tế bào đồng thời tích lũy quá nhiều NH3. Hậu quả của việc tích lũy NH3 là tế bào không kết hợp giữa quang hợp và quang hô hấp (hay mất khả năng cố định CO2), phá hủy màng tế bào lục lạp dẫn tới tạo đốm biến vàng và cuối cùng mô bị chết hoại (có quầng vàng bao quanh). Tabtoxin cũng làm giảm khả năng phản ứng chủ động của cây đối với vi khuẩn.

o Phaseolotoxin: do vi khuẩn Pseudomonas syringae pv.phaseolicola gây bệnh đốm quầng (halo-blight) đậu đỗ. Cây nhiễm bệnh hay được xử lý với phaseolotoxin đều cho triệu chứng giống nhau như: giảm sinh trưởng lá, phá vỡ mô đỉnh, tích lũy quá mức ornithin (một loại amino acid). Phaseolotoxin là một tripeptide gồm 3 amino acid (ornithine-alanine-arginine) chứa một nhóm phosphosulfinyl. Ngay khi vi khuẩn tiết ra phaseolotoxin, enzyme của cây sẽ cắt các liên kết peptide và giải phóng alanine, arginine và phosphosulfinyl-ornithine (là một hợp chất có hoạt tính sinh học). Độc tố có ảnh hưởng đến tế bào bằng cách bất hoạt enzyme ornithine carbamoyltransferase chịu trách nhiệm chuyển hóa ornithin thành citruline - tiền chất của arginine. Hậu quả là tế bào tích lũy quá mức ornithine, suy giảm nghiệm trọng citruline và arginine. Phaseolotoxin còn ảnh hưởng tới tổng hợp pyrimidine, giảm hoạt tính ribosome, tương tác với quá trình tổng hợp lipid, thay đổi tính thấm của màng và tích lũy tinh bột trong lục lạp.

o Tentoxin: do nấm Alternaria alternata (gây đốm và biến vàng trên nhiều loại cây) tạo ra. Tentoxin là một tetrapeptide vòng tương tác với một protein liên quan đến dẫn truyền năng lượng vào lục lạp (Chloroplast F(1) - ATPase/ CF(1)). Độc tố gây ức chế quá trình quang phosporyl hóa (photophosphorylation). Ở những loài cây mẫn cảm, tentoxin còn ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của lục lạp dẫn tới mô bị biến màu do mất khả năng tổng hợp chlorophyll. Ngoài ra, tentoxin còn ức chế hoạt tính của polyphenol oxydase cần cho phản ứng phòng thủ của cây.

o Cercosporin: do nấm Cercospora tiết ra. Nấm Cercospora gây nhiều bệnh đốm lá trên cây (ví dụ nấm Cercospora nicotianae gây bệnh đốm mắt của trên thuốc lá). Cercosporin là một perylenequinon chỉ gây độc cho tế bào khi được hoạt hóa bởi ánh sang.

Cercospora hấp thu năng lượng ánh sáng mặt trời để trở thành trạng thái hoạt hóa. Cercosporin hoạt hóa sẽ phản ứng với oxy để tạo ra các lớp oxy hóa độc đối với tế bào (ví dụ peroxyde O2- oxy hóa lipid của màng tế bào).

2        Độc tố chọn lọc ký chủ (host-selective or host-specific toxin)

§ Tác động chọn lọc: chỉ tác động đến loài cây ký chủ của tác nhân gây bệnh

§ Thường là yếu tố gây bệnh nghĩa là tác nhân gây bệnh chỉ có thể gây bệnh cùng với sự có mặt của độc tố do nó tiết ra.

§ Một vài ví dụ:

o Victorin (HV toxin): do nấm Cochliobolus victoriae tổng hợp nên và gây bệnh trên cây đại mạch. Nấm bệnh xuất hiện tại Mỹ năm 1945 và gây bệnh trên cây đại mạch Victoria. Chỉ có chủng nấm tạo HV toxin mới có khả năng gây bệnh trên giống đại mạch này. Victorin là một pentapeptide gây hại màng tế bào ký chủ, ức chế enzyme glycine decarboxylase do đó ảnh hưởng đến quang hô hấp của tế bào.

o T toxin: do chủng T của nấm Bipolaris maydis (Cochliobolus heterostrophus) tạo ra, gây bệnh đốm lá nhỏ trên ngô. Chủng T của nấm chỉ nhiễm trên dòng ngô bất dục đực tế bào chất. T toxin là một họ các phân tử polyketide có từ 35-47 gốc C (chủ yếu là 39 hoặc 41 C), tấn công ty thể và ức chế tổng hợp ATP. T toxin tương tác với protein là URF13 nằm phía trong màng ty thể, hình thành các lỗ trên màng ty thể dẫn tới làm mất tính thấm của ty thể. URF13 (do gen T-urf13) chỉ có ở dòng ngô bất dục đực tế bào chất.

Câu 5: Vai trò của hormone thực vật trong bệnh cây. Mô tả vai trò của hormone thực vật trong quá trình gây bệnh cây?

Tác nhân gây bệnh có thể gây bệnh cây thông qua các hormone thực vật. Các tác nhân gây bệnh có thể trực tiếp hoặc gián tiếp kích thích cây tổng hợp hormone thực vật. Ngoài ra, tác nhân gây bệnh cũng có thể tương tác với các chất tham gia quá trình tổng hợp hormone trong tế bào cây và làm biến đổi cân bằng hormone dẫn tới hình thành triệu chứng.

3        Auxin: điển hình nhất là Indol-3-acetic acid (IAA), cần cho sự kéo dài và biệt hóa của tế bào cây. IAA có thể ảnh hưởng đến tính thấm của màng tế bào, tăng hô hấp và thúc đẩy tổng hợp protein. Nồng độ IAA trong cây tăng lên là do 3 lý do:

Một số ví dụ

§ Nấm Ustilago maydis gây bệnh ung thư ngô

§ Nấm Plasmodiophora brassicae gây bệnh sưng rễ cây thập tự.

§ Vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cà chua, khoai tây. Vi khuẩn cảm ứng cây hình thành IAA (với nồng độ có thể gấp 100 lần). Trong trường hợp này, mặc dù không có sự biến đổi nhiều về hình thái của cây, nhưng hàm lượng IAA cao giúp cho các enzyme của vi khuẩn dễ dàng xâm nhập qua vách và màng tế bào cây.

§ Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens gây bệnh sưng u nhiều loại cây. Vi khuẩn sẽ chuyển gen tổng hợp auxin (và các chất sinh trưởng khác) nằm trên vùng T-DNA của Ti-plasmide vào genome của cây.

§ TMV: protein tái sinh (Rep protein) của TMV tương tác với protein Aux/IAA (điều khiển sự cân bằng auxin của cây) dẫn tới hình thành các triệu chứng.

4        Gibberellins: là hormone thực vật có tác dụng thúc đẩy sự ra hoa, kích thích sự kéo dài của thân và rễ, tăng trưởng quả... Gibberellins là một nhóm gồm khoảng 80 hợp chất trong đó gibberellic acid (GA3) là quan trọng nhất.

§ Một số tác nhân gây bệnh có thể tự tổng hợp được gibberellin. Ví dụ nấm Giberrella fujikuroi (Fusarium moniliforme) gây bệnh lúa von trên lúa.

§ Một số tác nhân có thể tương tác với các thành phần của ký chủ làm biến đổi hàm lượng gibberellin trong cây. Ví dụ Rice dwaft virus (RDV) là một virus gây bệnh lùn cây và lá màu xanh lục tối trên lúa. Protein P2 (là protein vỏ capside) của RDV tương tác với ent-kaurene oxydase của cây lúa. Ent-kaurene oxydase là enzyme chính chịu trách nhiệm tổng hợp gibberellin trong cây. Cây lúa bị nhiễm RDV có hàm lượng GA1 giảm rõ rệt và xử lý GA3 có thể làm mất triệu chứng lùn cây.

§ Tác nhân gây bệnh ức chế enzyme IAA oxidase dẫn tới IAA được hình thành tự nhiên trong cây không bị kiểm soát về nồng độ.

§ Tác nhân gây bệnh kích thích cây tạo nhiều IAA.

§ Tác nhân gây bệnh tự tổng hợp được IAA.

            Cytokinin: (điển hình là kinetin và zeatin) là hormone thực vật chịu trách nhiệm kích thích phân chia tế bào, chống già hóa, liên kết với ribosomes và điều khiển tổng hợp protein. Cytokinin cũng là receptor trên màng tế bào. Cytokinin được biết là tham gia trong quá trình hình thành các khối u do nấm Taphrina deforman (gây bệnh xoăn lá đào) và nấm Plasmodiophora brassicae (gây bệnh sưng rễ bắp cải).

Ethylene: được tạo ra tự nhiên trong cây và có ảnh hưởng tới nhiều chức năng sinh lý trong cây bao gồm biến vàng, rụng lá, kích thích hình thành rễ bên, thúc đẩy sự chín của quả. Trong bệnh cây, ethylene có một vai trò kép. Một mặt ethylene là phân tử dẫn truyền tín hiệu để thúc đẩy tính kháng của cây. Mặt khác ethylene là yếu tố độc, chịu trách nhiệm tăng cường triệu chứng hoặc khả năng phát triển của tác nhân gây bệnh. Ví dụ dòng vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. glycinea đột biến mất khả năng hình thành ethylene sẽ không thể phát triển tốt trên lá đậu. Nhiều tác nhân gây bệnh kích thích cây hình thành nhiều ethylene và tạo ra một số triệu chứng như epinasty (ngọn, thân, lá bị cuốn cong gập xuống). Ví dụ ethylene chịu trách nhiệm về triệu chứng epinasty và rụng lá trên cây bông nhiễm nấm Verticillium dahliae, các triệu chứng biến vàng, còi cọc do nhiễm Cucumber mosaic virus.

Câu 6: Phân loại tác nhân gây bệnh theo tính ký sinh và phương thức sử dụng nguồn thức ăn (dinh dưỡng). Ví dụ mỗi loại?

            Có thể xem quan hệ của các tác nhân gây bệnh với cây ký chủ là quan hệ ký sinh (parasitic). Quan hệ ký sinh là quan hệ mà một sinh vật sẽ được hưởng lợi còn sinh vật kia bị gây hại. Dựa theo mức độ ký sinh trên cây, tác nhân gây bệnh cây có thể được chia làm 3 nhóm là ký sinh chuyên tính, bán ký sinh, bán hoại sinh. Một nhóm nữa, không gây bệnh cho cây nhưng cũng được xét đến đó là nhóm hoại sinh.

§ Ký sinh chuyên tính (obligate parasite): chỉ có thể gây bệnh trên mô và tế bào sống. Ví dụ là nấm gỉ sắt, phấn trắng, sương mai, phytoplasma hoặc virus. Các ký sinh chuyên tính, nhìn chung không thể nuôi cấy trên môi trường nhân tạo.

§ Bán ký sinh (hay còn gọi là hoại sinh có điều kiện - facultative saprophyte): sống ký sinh trên tế bào sống là chủ yếu nhưng vẫn có khả năng sống trên tàn dư, mô suy nhược hoặc đã chết. Ví dụ điển hình là nhiều loại nấm túi Cercospora (gây các bệnh đốm lá).

§ Bán hoại sinh (hay còn gọi là ký sinh có điều kiện - facultative parasite): chủ yếu sống trên tế bào suy nhược, đã chết, trên tàn dư cây trồng, trên đất, trên hạt, quả, nhưng có thể ký sinh trên tế bào sống. Ví dụ nấm mốc đen Rhizopus, nấm chổi Penicillium, nấm Botrytis.

§ Hoại sinh (saprophyte): chỉ có thể sống ở trên các tế bào đã chết, tàn dư, đất. Các loại này đóng một vai trò quan trọng trong việc phân hủy các vật chất hữu cơ trong đất trồng. Một số là vi sinh vật đối kháng có thể được sử dụng trong việc phòng ngừa bệnh cây (biện pháp sinh học) như nấm Trichoderma.

3        Theo phương thức sử dụng nguồn dinh dưỡng, tác nhân gây bệnh có thể được chia thành 3 nhóm:

§ Nhóm sinh dưỡng (biotroph): Sử dụng nguồn thức ăn từ mô ký chủ sống. Các ví dụ điển hình là nấm sương mai (Phytophthora parasitica), gỉ sắt và phấn trắng (Erysiphe cichoracearum). Nhóm sinh dưỡng, nhìn chung có phổ ký chủ hẹp và không giết chết tế bào ký chủ ngay sau khi xâm nhiễm; mà thay vào đó chúng để tế bào ký chủ sống càng lâu càng tốt vì chúng phụ thuộc vào quá trình trao đổi chất nguyên vẹn của tế bào ký chủ để thực hiện quá trình dinh dưỡng và sinh sản. Điều này tạo cơ hội cho ký chủ có thể thiết lập được các phản ứng phòng thủ có liên quan đến gen kháng. Đối với nấm thuộc nhóm sinh dưỡng, phương thức hấp thụ dinh dưỡng thường được thực hiện nhờ vòi hút (haustorium). Mô bị chết hoại hình thành chỉ sau khi nấm đã hoàn thành quá trình sinh sản.

§ Nhóm hoại dưỡng (necrotroph): Sử dụng nguồn thức ăn từ mô chết hoặc đang chết. Các ví dụ điển hình là nấm Botrytis cinerea, Alternaria brassicicola, Rhizoctonia solani. Nhóm hoại dưỡng, nhìn chung có phổ ký chủ rộng hơn nhiều và ngay sau khi xâm nhiễm, chúng ngay lập tức giết chết tế bào ký chủ rất sớm và tạo ra một loạt các độc tố mà chúng dường như thúc đẩy tế bào chết. Vì tế bào ký chủ chết rất sớm nên nhìn chung tế bào không đủ thời gian để thiết lập các phản ứng phòng thủ thông qua gen kháng. Tuy nhiên, từ các mô xung quanh vết chết hoại có thể tạo được phản ứng kháng nhờ các chất khuếch tán từ vết bệnh.

§ Bán sinh dưỡng (semi-biotroph): Một số vi sinh vật có kiểu sinh dưỡng hỗn hợp. Ví dụ vi khuẩn Pseudomonas syringae có lúc được xem như thuộc nhóm sinh dưỡng, có lúc được xem như thuộc nhóm hoại dưỡng. Vi khuẩn xâm nhập vào cây qua tổn thương cơ giới hoặc khí khổng. Trong giai đoạn đầu của sự nhiễm bệnh vi khuẩn không giết chết tế bào ký chủ, nhưng về sau vi khuẩn lại giết chết tế bào ký chủ.

Câu 7: Nêu đặc điểm phòng thủ thụ động của cây?

Nhìn chung cây chống lại tác nhân gây bệnh nhờ kết hợp các vũ khí từ hai kho vũ khí là: các đặc điểm cấu trúc: có vai trò là các rào cản vật lý ngăn cản tác nhân gây bệnh xâm nhập vào và phát triển trong cây và các phản ứng sinh hóa: xảy ra trong tế bào và mô cây, hình thành các chất hoặc là độc đối với tác nhân gây bệnh hoặc tạo điều kiện ức chế sự sinh trưởng của tác nhân gây bệnh. Sự kết hợp hai kho vũ khí này khác nhau tùy thuộc vào tổ hợp ký sinh-ký chủ. Ngoài ra, thậm chí cùng kiểu ký sinh-ký chủ thì sự kết hợp này cũng khác nhau tùy thuộc tuổi cây, loại cơ quan hoặc mô bị tấn công, điều kiện dinh dưỡng của cây hoặc điều kiện thời tiết. Các vũ khí cấu trúc và hóa học thuộc cơ chế phòng thủ thụ động của cây thường có sẵn từ trước và không đặc hiệu.

            Phòng thủ nhờ rào cản vật lý có sẵn: Nhìn chung phòng tuyến đầu tiên là bề mặt cây ký chủ, nơi tác nhân gây bệnh tiếp xúc và xâm nhập. Các đặc điểm cấu trúc bề mặt ảnh hưởng tới sự tiếp xúc và xâm nhập của tác nhân gây bệnh bao gồm:

§ Lớp sáp: tạo ra bề mặt ghét nước, do đó ngăn cản sự hình thành màng nước cần cho bào tử nấm tiếp xúc, nảy mầm và vi khuẩn nhân lên. Mật độ lông lá dày cũng có ảnh hưởng tương tự và cũng có thể làm giảm sự nhiễm bệnh.

§ Tầng cutin: có khả năng ngăn cản các tác nhân gây bệnh có kiểu xâm nhập trực tiếp. Tuy nhiên, độ dày tầng cutin không luôn luôn quan hệ tỉ lệ thuận với tính kháng.

§ Lớp tế bào biểu bì: Độ dày và độ cứng của vách tế bào biểu bì dường như là một yếu tố quan trọng đối với tính kháng của một vài tổ hợp ký sinh-ký chủ. Vách dày và cứng của tế bào biểu bì có thể ngăn cản sự xâm nhập trực tiếp của tác nhân gây bệnh. Cây có đặc điểm này thường biểu hiện tính kháng, nhưng trong trường hợp tác nhân gây bệnh được đưa vào các mô bên dưới nhờ tổn thương cơ học thì tính kháng này không được biểu hiện.

§ Đặc điểm khí khổng: Một vài loài nấm và vi khuẩn chỉ có khả năng xâm nhập qua khí khổng, mặc dù phần lớn chúng có khả năng xâm nhập qua khí khổng đóng, nhưng đối với một vài loài như nấm gỉ sắt thân lúa mỳ chỉ có khả năng xâm nhập qua khí khổng mở. Chính vì vậy một số giống lúa mỳ có khí khổng mở muộn trong ngày là kháng bệnh vì ống mầm của bào tử nấm (hình thành nhờ sương đêm) sẽ bị khô trước khi khí khổng mở. Ngoài ra, khí khổng với cấu tạo lỗ mở hẹp cũng có khả năng ngăn cản sự xâm nhập của vi khuẩn.

§ Tế bào bên trong: Vách tế bào của mô đang bị xâm nhập thường thay đổi độ dày và độ cứng, đôi khi cũng ức chế sự phát triển cả bệnh. Sự có mặt của nhiều tế bào cương mô trong thân của nhiều loại ngũ cốc có thể hạn chế sự phát triển của một số bệnh như bệnh gỉ sắt hại thân. Ngoài ra, các tế bào xylem, bó bẹ (bundle sheat), cương mô của gân lá cũng giới hạn sự phát triển của một số bệnh đốm lá do nấm, vi khuẩn, một số loại tuyến trùng và tạo ra các vết bệnh ở góc cạnh. Tế bào xylem dường như liên quan trực tiếp hơn đến mức độ kháng hay mẫn cảm của các loại bệnh hại mạch dẫn. Ví dụ, đường kính tế bào, tỉ lệ tế bào mạch xylem có kích thước lớn có mối tương quan thuận với độ mẫn cảm của cây du (elm) do nấm Ophiostoma novo-ulmi.

            Phòng thủ nhờ các chất hóa học có sẵn: Mặc dù rào cản vật lý có khả năng tạo ra một số mức độ phòng thủ nhưng nhìn chung, sự tấn công của tác nhân gây bệnh không phụ thuộc nhiều vào rào cản này. Thực tế là nhiều tác nhân gây bệnh không thể xâm nhập mặc dù không có trở ngại cấu trúc của ký chủ. Phòng thủ hóa học chắc chắn đóng vai trò quan trọng hơn trong cơ chế phòng thủ bị động của cây. Một số hợp chất hóa học có sẵn và phổ biến bao gồm: Phenolics (phenols, phenolic acids, quinones, flavonoids, flavonones, flavenols, tannins, coumarins); Terpenoids (capsaicin); Alkaloids (berberin, piperine); Lectins và Polypeptides (mannose, fabatin).

§ Các chất ức chế được cây tiết ra bên ngoài: Cây có thể tiết ra một số hợp chất có tính độc đối với nấm bệnh. Ví dụ lá cà chua và củ cải đường tiết ra một số chất kháng nấm, ức chế sự nảy mầm bào tử nấm Botrytis và Cercospora, củ hành tây vỏ trắng bị nhiễm bệnh thán thư (Colletotrichum circinans) còn củ có vỏ đỏ không bị nhiễm do củ vỏ đỏ có khả năng tạo ra các hợp chất phenolics (protocatechuic acid và catechol) có khả năng ức chế sự nảy mầm của nấm. Phun cây hướng dương bằng acibenzola-S-methyl (ASM hay BTH) có thể chống bệnh gỉ sắt (Puccinia helianthi) do ASM có khả năng kích thích cây tiết ra coumarin và các hợp chất phenolics ngăn cản sự nảy mầm và hình thành giác bám của bào tử nấm.

§ Các chất ức chế có sẵn trong tế bào cây: Một số hợp chất như tannin, phenolic và các hợp chất giống acid béo (diene) có sẵn ở nồng độ cao trong tế bào lá non, quả non hoặc hạt có khả năng chống một số loại nấm nào đó, chẳng hạn như Botrytis. Nhiều hợp chất tương tự có khả năng ức chế hoạt động của các enzyme thủy phân, kể cả enzyme phân hủy pectin của tác nhân gây bệnh. Khi mô non trở nên già, nồng độ các chất ức chế này giảm nên tính kháng cũng giảm theo.

§ Catechin (có nhiều trong lá dâu tây) có khả năng ức chế sự hình thành đế xâm nhiễm của bào tử nấm Alternaria alternata. Nhiều hợp chất khác chẳng hạn như saponin (là các hợp chất glycoside của triterpen và steroid; ví dụ điển hình là tomatin trong cà chua) ức chế các nấm thiếu enzyme saponinase phân hủy saponin. Ngoài ra, ở một số cây còn có một số chất, mà có bản chất là các phân tử protein có trọng lượng phân tử thấp gọi là phytocystatin ức chế các enzyme proteinase nhóm cystein có trong hệ tiêu hóa của tuyến trùng và cũng do một số nấm tiết ra. Một nhóm hợp chất nữa gọi là lectin - là các protein liên kết đặc hiệu với đường. Lectin có nhiều trong hạt của nhiều loại cây mà có khả năng dung tan hoặc ức chế sinh trưởng của nhiều loại nấm.

Câu 8: Đặc điểm phòng thủ chủ động nhờ hình thành cấu trúc bảo vệ của cây?

Cây phản ứng lại sự tấn công của tác nhân gây bệnh bằng cách hình thành 4 loại cấu trúc phòng thủ đặc biệt:

            Cấu trúc hình thành lien quan đến tế bào chất của tế bào bị tấn công và được gọi là phản ứng phòng thủ tế bào chất: trong một vài trường hợp đối với các tác nhân ký sinh yếu, chẳng hạn một số chủng nấm Armillaria gây bệnh cây thân gỗ, thì tế bào chất của tế bào ký chủ bao quanh cụm sợi nấm, nhân bị kéo căng và vỡ làm đôi. Trong một số trường hợp, tế bào chất của tế bào ký chủ trở nên đậm đặc và kết hạt, cuối cùng sợi nấm bị phân hủy.

Cấu trúc liên quan đến vách tế bào bị xâm nhập được gọi là: cấu trúc phòng thủ vách tế bào: vách tế bào có thể biến đổi về hình thái để phản ứng lại sự xâm nhiễm của tác nhân gây bệnh, mặc dù kiểu phản ứng này tương đối kém hiệu quả. Trong đó có 4 loại biến đổi chính:

§ Lớp ngoài của vách tế bào nhu mô đang tiếp xúc với vi khuẩn gây bệnh sẽ phồng lên và tạo ra các vật liệu dạng sợi, vô định hình; các vật liệu này sẽ bao quanh và ngăn cản sự nhân lên của vi khuẩn.

§ Vách tế bào hóa dày nhờ một chất có bản chất cellulose; cấu trúc này thường liên kết với các hợp chất phenolic và ngăn cản sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh.

§ Vách tế bào bị lignin hóa nhằm tăng cường khả năng chống lại sự xâm nhập của nấm tạo vòi áp; ngoài ra, sự lignin hóa cũng kháng nước do đó làm giảm hoạt tính của các emzyme phân hủy vách tế bào.

§ Hình thành các núm cấu tạo bởi callose (callose papillae: callose là một polysaccharide thực vật có bản chất là glucose, được hình thành bởi enzyme callose synthetase và bị phân hủy bởi enzyme glucanase). Các núm này hình thành vài phút sau khi tế bào bị tổn thương và khoảng 2-3 giờ sau khi lây nhiễm tác nhân gây bệnh. Mặc dù chức năng chính của núm callose là sữa chữa các tổn thương vách tế bào, thì trong một số trường hợp núm cũng có tác dụng ngăn cản sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh. Trong một số trường hợp các hợp chất callose bao quanh đỉnh sợi nấm xâm nhập, liên kết với các hợp chất phenolic và hình thành một ống bao quanh sợi nấm.

Cấu trúc liên quan đến mô cây phia trước tác nhân gây bệnh (sâu hơn về phía cây) và được gọi là: cấu trúc phòng thủ mô:

§ Hình thành lớp bần (cork layer): Sự xâm nhiễm của nấm, vi khuẩn, một số virus và tuyến trùng thường kích thích sự hình thành các lớp bần phía trước điểm xâm nhiễm. Bần là mô vỏ (thân, rễ) cấu tạo chủ yếu bởi suberin. Các lớp bần ngăn cản tác nhân gây bệnh phát triển xa hơn, đồng thời ngăn cản các độc tố của tác nhân gây bệnh khuếch tán ra phần mô khỏe và ngăn cản sự vận chuyển nước và dinh dưỡng từ phần mô khỏe và phần mô bị nhiễm bệnh. Mô bị chết hoại cùng với tác nhân gây bệnh, bị giới hạn bởi các lớp bần, có thể vẫn ở nguyên vị trí và tạo ra các vết bệnh kiểu vết đốm mà hình dạng, màu sắc và kích thước phụ thuộc vào tổ hợ ký sinh - ký chủ. Đối với một số bệnh, phần mô chết hoại có thể bị mô khỏe phía dưới đẩy lên tạo thành các vết ghẻ hoặc vết vảy, và do đó loại bỏ hoàn toàn tác nhân gây bệnh.

§ Hình thành tầng rời (abscission layer): phiến giữa của hai lớp tế bào bao xung quanh vết bệnh tách khỏi nhau tạo thành một lớp trống gọi là tầng rời. Sự hình thành tầng rời sẽ cô lập phần mô bệnh và thông thường, mô bệnh sẽ tách khỏi mô khỏe tạo ra các lỗ thủng. Sự hình thành tầng rời rất hay bắt gặp trên các lá non đang phát triển của cây quả hạch.

§ Hình thành tylose: Tylose hình thành trong mạch xylem của hầu hết cây bị stress hoặc bị tác nhân gây bệnh hại mạch dẫn tấn công. Tylose là sự sinh trưởng quá mức của protoplasm của tế bào nhu mô bao quanh tế bào xylem và nhô vào trong mạch xylem. Tylose có vách bằng cellulose và do kích thước cũng như số lượng nhiều của nó trong mạch xylem dẫn tới bịt kín mạch xylem ngăn không cho tác nhân gây bệnh phát triển tiếp. Ở một số giống kháng, tylose hình thành rất nhiều và nhanh ngay ohias trước đường tiến của tác nhân gây bệnh trong rễ non và do đó ngăn cản không cho tác nhân gây bệnh phát triển tiếp.

§ Hình thành gôm: Nhiều loại cây, đặc biệt là các cây quả hạch, hình thành gôm ở xung quanh vị trí xâm nhiễm và tạo ra một rào cản không thể vượt qua đối với các tác nhân gây bệnh.

Câu 9: Đặc điểm phòng thủ chủ động sinh hóa của cây?

·    Phytoalexin:

§ Khái niệm: Phytoalexin là các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp, có tính kháng vi sinh vật và được tạo ra bởi cây do hậu quả của sự nhiễm bệnh hoặc các stress sinh học.

§ Đặc điểm: Phytoalexin được tạo ra trên các tế bào khỏe xung quanh, nhằm phản ứng với các chất khuếch tán ra từ các tế bào bị xâm nhiễm hoặc tổn thương. Sự hình thành và tích lũy phytoalexin mang tính cục bộ (có nghĩa phytoalexin không lưu dẫn xa khỏi vị trí xâm nhiễm hoặc tổn thương), và xảy ra khá nhanh (khoảng vài giờ tới tối đa 2 ngày sau lây nhiễm).

§ Các nguồn kích thích hình thành phytoalexin: Các chất kích thích hình thành phytoalexin được gọi là các elicitor. Số lượng và nguồn gốc elicitor rất đa dạng. Nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng (đặc biệt là nấm) là các nhóm tác nhân gây bệnh được biết là tạo ra các elicitor cảm ứng hình thành phytoalexin. Phần lớn các chất elicitor là các hợp chất cao phân tử như các chất cấu tạo vách tế bào nấm (glucan, chitosan, glycoprotein và polysaccharide; các hợp chất này được giải phóng từ vách tế bào nấm nhờ enzyme của tế bào ký chủ). Phần lớn các elicitor là không đặc hiệu (có nghĩa chúng có mặt trên các chủng tác nhân gây bệnh khác nhau và kích thích tạo phytoalexin trên cả giống nhiễm và giống kháng). Mặc dù phần lớn các elicitor có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh thì trong một số trường hợp các hợp chất này lại có nguồn gốc từ tế bào cây. Ví dụ: enzyme galacturonase của tác nhân gây bệnh phân hủy acid galacturonic, một chất cấu tạo nên vách tế bào cây, thành các oligomer có hoạt tính kích thích cây tạo phytoalexin.

§ Phytoalexin hình thành và tích lũy trên mô của cả giống kháng và giống nhiễm. Khi phytoalexin tích lũy tới một nồng độ nào đó sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật (thường là nấm). Các loài/chủng nấm có tính gây bệnh có xu hướng kích thích hình thành phytoalexin với nồng độ thấp hơn so với các loài/chủng không có tính gây bệnh. Ngoài ra, các loài/chủng nấm không có tính gây bệnh cũng dường như kém mẫn cảm với tính độc của phytoalexin hơn so với các loài/chủng nấm có tính gây bệnh..

§ Phytoalexin rất đa dạng về số lượng, cấu trúc. Khoảng 350 chất có tính chất giống phytoalexin đã được phát hiện từ khoảng 30 họ thực vật, trong đó có khoảng 150 chất được phân lập trên cây họ đậu (Leguminosae). Phần lớn phytoalexin được phân lập trên cây hai lá mầm, một số được phân lập trên cây một lá mầm. Cấu trúc hóa học của phytoalexin được phân lập từ một họ cây thường khá giống nhau. Các phytoalexin thuộc nhóm phenylpropanoid phổ biến trong nhiều họ thực vật như Leguminosae, Solanaceae, Convolvulaceae, Umbelliferae và Gramineae; các phytoalexin thuộc nhóm isoflavonoid phổ biến trong họ Leguminosae; các phytoalexin thuộc nhóm sesquiterpenoid phổ biến trong họ Solanaceae.

§ Một số phytoalexin được nghiên cứu nhiều là pisatin (trên đậu Hà Lan), glyceolin (trên đậu tương, cỏ 3 lá, cỏ alfafa), rhisitin (trên khoai tây), capsidiol (trên ớt), cammaxin (trên cây Arabidopsis).

·    Các hợp chất phenolic:

§ Các hợp chất phenolic đơn giản: Một số hợp chất phenolic phổ biến thường hình thành và tích lũy với tốc độ nhanh hơn trên cây bị bệnh, đặc biệt trên các giống kháng. Một số các hợp chất phenolic phổ biến là chlorogenic acid, caffeic acid, ferulic acid. Ví dụ quả đào xanh và quả đào trên giống kháng hình thành nhiều chlorogenic acid khi bị nhiễm nấm Monilinia fructicola. Hợp chất phenolic này ngoài gây độc trực tiếp đối với nấm thì quan trọng hơn còn ức chế các enzyme của nấm dùng để phân hủy mô ký chủ.

§ Các hợp chất phenolic độc hình thành từ các hợp chất phenolic không độc: Nhiều cây chứa các chất glycoside (ví dụ như đường glucose) liên kết với các phân tử phenolic. Ở trạng thái liên kết, các hợp chất này không độc. Một số loại nấm và vi khuẩn có thể hình thành hoặc kích thích mô cây hình thành các enzyme glycosidase thủy phân các hợp chất trên và giải phóng các hợp chất phenolic độc.

§ Vai trò của các enzyme oxy hóa các hợp chất phenolic: Nhiều hợp chất phenol trong cây có độc tính thấp đối với tác nhân gây bệnh. Trong nhiều trường hợp, trong mô nhiễm bệnh của các giống kháng bệnh, hoạt tính của các enzyme oxy hóa phenol (ví dụ polyphenol oxydase) nhìn chung được tăng cường. Các enzyme này sẽ oxy hóa các hợp chất phenolic thành các hợp chất quinone có tính độc mạnh hơn. Một cơ chế khác: Trong quả xanh thường chứa các dien (là các hợp chất hydrocarbon có chứa 2 liên kết kép), có tính độc cao đối với tác nhân gây bệnh. Khi quả chín, lượng lipoxygenase cũng gia tăng dẫn tới các dien bị bẻ gẫy, làm mất tính kháng của quả chín. Ở một số loại quả, elicitor từ nấm không gây bệnh đã kích thích hình thành một hợp chất phenolic gọi là epicatechin. Epicatechin ức chế enzyme lipoxygenase dẫn tới lượng dien không bị giảm và quả chín vẫn có thể kháng được sự xâm nhiễm của nấm (đặc biệt là nấm thán thư - Colletotrichum circinans).

·    PR-protein (pathogenesis related - protein):

§ Định nghĩa: Protein liên quan đến sự gây bệnh (PR protein) là các protein được cây tạo ra do sự gây bệnh bởi các tác nhân gây bệnh chủ yếu thuộc nhóm nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng. Ngoài ra, sự tấn công của côn trùng (đặc biệt là nhóm chích hút) cũng kích thích cây tạo ra PR protein. Hiện có khoảng 17 nhóm (còn được gọi là các họ) PR protein khác nhau, được ký hiệu từ PR1 đến PR 17 (theo thứ tự được phát hiện. Nhiều nhóm có hoạt tính kháng nấm.

§ PR-1: Là nhóm protein có số lượng nhiều nhất, thường hình thành trong cây với hàm lượng rất cao sau khi bị nhiễm bệnh (có thể đạt tới 1-2% tổng lượng protein lá). Protein của nhóm này đã được phát hiện thấy trên tất cả các loại cây được kiểm tra. Các protein chức năng tương tự PR-1 cũng được phát hiện thấy ở nhiều sinh vật khác như nấm, côn trùng, động vật có xương sống (kể cả người). Mặc dù chức năng sinh học và cơ chế hoạt động của nhóm này chưa rõ nhưng các PR-1 có hoạt tính kháng nấm cả invitro và invivo. Các protein PR-1 có thể chỉa thành 2 nhóm hoặc kiềm hoặc acid. Trên thuốc lá, có ít nhất 16 protein PR-1 đã được khám phá, trong đó có 3 protein loại acid (PR-1a, PR-1b, PR-1c) và 1 protein kiềm (PR-1g) hình thành khi cây bị nhiễm virus khảm thuốc lá Tobacco mosaic virus. Trên lúa có 23 gen mã hóa protein PR-1. Trên ớt, sự biểu hiện của gen PR-1 loại kiềm được cảm ứng bởi TMV đã tạo tính kháng đối với Phytophthora parasitica var nicotianae, Ralstonia solanacearum, và Pseudomonas syringae pv tabaci.

§ PR-2: (b-1.3-glucanase) là nhóm protein có mặt trong nhiều loại cây, động vật và vi sinh vật. Glucanase có thể chia thành 3 nhóm: nhóm I là các glucanase có tính kiềm hình thành ở không bào; nhóm II và III có tính acid và là các protein ngoại bào. Glucanase thuộc nhóm I có hoạt tính kháng nấm cả invitro và invivo. Glucanase thuộc nhóm II và III chỉ có hoạt tính kháng nấm nếu phối hợp với glucanase nhóm I hoặc chitinase. Đặc tính kháng nấm của glucanase là khả năng phân hủy vách tế bào của nấm (cấu tạo bởi glucan).

§ PR-3 (chitinase lớp I, II, IV, VI, VII), PR-8 (chitinase lớp III) và PR-11 (chitinase lớp V). Các chitinase là loại protein chiếm số lượng lớn thứ 2 trong các PR protein. Các chitinase thực vật được chia làm 7 lớp (I, II....VI) căn cứ vào cấu trúc protein, tính đặc hiệu cơ chất, cơ chế xúc tác và tính mẫn cảm với các chất ức chế. 7 lớp này lại được xếp vào 3 nhóm PR protein. Các chitinase có hoạt tính kháng nấm bằng cách xúc tác cho phản ứng thủy phân để cắt liên kết β-1,4-glycoside của N-acetyl-D-glucosamine (chitin, thành phần của vách tế bào nấm). Cần chú ý là phản ứng thủy phân này tạo ra các oligosaccharide có vai trò là elicitor cho các phản ứng phòng thủ khác.

§ PR-4 (protein liên kết chitin). Hoạt tính kháng nấm của các protein nhóm PR-4 là do khả năng liên kết với chitin của vách tế bào nấm dẫn tới ức chế sinh trưởng của nấm. Loại PR-4 phổ biến nhất là legumin và vicilin (chiếm tới 80% hàm lượng protein của hạt đậu). Vicilin đã được chứng minh có khả năng ức chế sinh trưởng và nảy mầm bào tử của nhiều loại nấm như Fusarium solani, F. oxysporum, Collectotrichum musae, Phytophthora capsici, Neurospora crassa, Ustilago maydis. Vicilin cũng được biết là có khả năng kháng cả côn trùng như một đậu (Callosobruchus maculatus).

§ PR-5 (Thaumatin-like proteins). Osmotin và thaumatin-like (TL) protein là các protein có tính kiềm và có mức tương đồng chuỗi aa đáng kể với thaumatin (một protein có vị ngọt, phân lập từ cây Thaumatococcus danielli. Osmotin và TL tương tác với màng tế bào nấm và hình thành các lỗ thủng xuyên màng. Hai loại protein này cũng có hoạt tính 1,3-glucanase, liên kết với actin. Osmotin trên thuốc lá kích thích MAPK do đó phá vỡ 1 đường hướng dẫn truyền tín hiệu (dựa vào MAPK) nhằm tăng cường tính ổn định của vách tế bào nấm. TL protein có mặt trong nhiều loài cây.

§ PR-6. Là họ các protein ức chế protease. Các protein PR6 có thể ức chế các protease nhóm aspartic, serine, cystein.

§ PR-12 (Defensins) và PR-13 (thionins). Defensin và thionin là các protein có trọng lượng phân tử nhỏ (~5 kD), kích thước khoảng 45-54 aa. Các protein này là các protein hoạt động trên màng, phát hiện thấy ở tất cả các nhóm sinh vật và độc đối với nấm. Cơ chế gây độc đối với nấm của các loại protein này vẫn chưa rõ nhưng defensin đã được chứng tỏ là làm tăng vận chuyển ion K+ ra ngoài màng, tăng hấp thụ Ca+2 của nấm Neurospora crassa. Chất defensin Dm-AMP1 của cây thược dược có thể tương tác đặc hiệu với sphingolipid của nấm men Sacharomyces cerevisiae.

§ PR-14 (Protein vận chuyển lipid-LTP). Các LTP là các protein nhỏ, có tính kiềm. LTP vận chuyển phospholipid qua màng. Phân tử LTP có cấu hình gồm một xoang ghét nước chạy dọc phân tử. Phân tử LTP khi tương tác với màng tế bào nấm sẽ tự gắn xuyên qua màng tế bào và xoang ghét nước sẽ tạo ra các lỗ dò trên màng tế bào nấm và nấm sẽ chết. Ngoài ra, một LTP từ cây Arabidopsis đã được chứng minh có khả năng vận chuyển các các phân tử tín hiệu trong phản ứng SAR.

Câu 10 : Khái niệm sự chết tế bào được lập trình (PCD), apoptosis và phản ứng siêu nhạy (HR).?

·   Sự chết tế bào được lập trình (PCD)

PCD là quá trình tự chết của tế bào, có những biến đổi hình thái đặc trưng, diễn ra theo một trình tự nhất định, được điều khiển bởi di truyền, nhằm đạt được và duy trì trạng thái cân bằng trong quá trình phát triển và chống lại các street môi trường và sự tấn công của tác nhân gây bệnh.

PCD xuất hiện thường xuyên trong suốt đời sống thực vật, trong quá trình biệt hóa cơ quan, mô và tế bào. Các ví dụ là:

Sự hình thành và phát triển hoa: hoa đực hình thành do PCD ở các tế bào vòi nhụy, noãn hình thành trước đó; và ngược lại, hoa cái hình thành do PCD ở các tế bào nhị đực.

Các tế bào chóp rễ bị chết do PCD trong quá trình phát triển; hoặc các rễ bên hình thành mới tại vị trí có dinh dưỡng hoặc nước còn các rễ già không chức năng sẽ chết do PCD.

          Tầng aleuron sẽ chết do PCD sau khi phôi phát triển.

Hai dạng chính của PCD là tự thực bào (autophagy) và apoptosis. Ngoài ra, nhằm chống lại sự tấn công của tác nhân gây bệnh, thực vật còn phát triển một loại PCD nữa là phản ứng siêu nhạy (Hypersensitive Resopnse - HR).

·  Apoptosis

Apoptosis là một dạng PCD và hiện đang nhận được nhiều chú ý trong nghiên cứu y sinh và cả tính kháng bệnh ở thực vật. Apoptosis là một quá trình chết sinh lý nhằm loại bỏ có chọn lọc các tế bào không mong muốn. Quá trình apoptosis có một số đặc điểm sau: tế bào chất bị nhăn, màng tế bào chất bị phồng, mất tiếp xúc giữa các tế bào, nDNA (DNA nhân) bị phân cắt tại các vị trí bên trong nhiễm sắc thể, tăng cường luồng ion Ca vào tế bào, hoạt hóa một số enzyme đặc biệt và giải phóng cytochrome c khỏi ty thể. Ngoài ra apoptosis liên quan đến đường hướng dẫn truyền tín hiệu dựa vào ceramide (là một họ các phân tử chất béo; một ceramide gồm một phân tử sphingosin và một phân tử acid béo). Các ceramide là các phân tử gắn trên màng.

Người ta đã phát hiện thấy một số độc tố nấm như fumonisinB (do nấm Fusarium moniliforme) và AAL toxin (do nấm Alternaria alternate) có khả năng ức chế các enzyme ceramidase dẫn tới hoạt hóa phản ứng apoptosis.

·  Phản ứng siêu nhạy - HR

Một trong các dấu hiệu của tính kháng bệnh là phản ứng siêu nhạy. Phản ứng siêu nhạy (HR) được định nghĩa là sự chết nhanh chóng và cục bộ của tế bào thực vật tại vị trí nhiễm bệnh.

HR có thể được cảm ứng bởi nhiều nhóm tác nhân gây bệnh (nấm sinh dưỡng, vi khuẩn, virus và tuyến trùng). HR thường xuất hiện trong nhiều tính kháng: tính kháng phi kí chủ/kí chủ, tính kháng thông qua gen R, tính kháng đơn gen/đa gen...

HR là hậu quả của một dòng thác các phản ứng dẫn truyền tín hiệu và phòng thủ tại các tế bào bị xâm nhiễm hoặc lân cận dẫn tới hình thành các chất độc (ví dụ các hợp chất phenolic bị oxy hóa) đầu độc cả tế bào lẫn tác nhân gây bệnh. Ngoài ra, nếu tác nhân gây bệnh không chết thì mô bị chết hoại cũng ngăn không cho tác nhân gây bệnh lan truyền tiếp. Cần chú ý là, trong nhiều trường hợp, HR không hình thành vết chết hoại có thể nhìn thấy bằng mắt thường vì HR xuất hiện chỉ ở tế bào nhiễm bệnh hoặc ở vài tế bào xung quanh.

HR của tế bào ký chủ có một số đặc điểm khá khác biệt so với các dạng PCD khác, nhất là về biến đổi hình thái của tế bào ký chủ. Nghiên cứu phản ứng siêu nhạy giữa nấm Uromyces vignae và đậu đũa, giữa nấm Erysiphe graminis f.sp hordei và tiểu mạch thấy các sự kiện sau: (1) nhân tế bào ký chủ di chuyển tới vị trí xâm nhiễm, dòng tế bào chất mất linh động, trở nên căng; (ii) tế bào chất ngừng chuyển động, các cơ quan tử chuyển động Brown, nhân hóa đậm đặc, tích lũy các thể hạt ở ngoại vi tế bào chất, nguyên sinh chất trở nên nhăn; và (iii) tế bào chất sụp đổ, tế bào chết. Các nghiên cứu gần đây còn cho thấy trong phản ứng HR, các loại màng bị mất chức năng, tế bào chất hóa không bào mạnh (vacuonization), phá hủy không bào và hình thái ty thể bị biến đổi toàn diện (ty thể bị phồng lên và rãnh ty thể bị phá hủy). Ngoài ra một đặc điểm để phân biệt khác là tốc độ phản ứng. Nhìn chung, HR diễn ra rất nhanh: khi nghiên cứu tổ hợp nấm Phytophthora infesstans/ khoai tây và sử dụng kính hiển vi video, người ta đã quan sát thấy tế bào ký chủ sụp đổ và chết sau 26 giây và nấm chết sau đó khoảng 20 giây; vết chết hoại có thể quan sát thấy bằng mắt sau nhiều giờ (ví dụ sau 8-12 giờ sau khi lây nhiễm vi khuẩn Erwinia carotovora mang gen HrpEcc trên thuốc lá).

Việc phân biệt HR và các dạng PCD khác không dễ dàng. Trong một số trường hợp, HR có biểu hiện biến đổi hình thái giống như apoptosis chẳng hạn như: khi nhiễm nấm gỉ sắt Uromyces vignae trên giống đậu đũa kháng bênh đã tạo ra phản ứng HR, trong đó nDNA của các tế bào chết hoại đã bị phân cắt thành thang DNA, một dấu hiệu của apoptosis. Hơn nữa các đường hướng nhận biết, dẫn truyền tín hiệu và các đặc trưng sinh hóa khá giống nhau giữa HR và apoptosis, chẳng hạn đều có sự liên quan đến dòng thác ion (Ca+2, K+1) vào/ra tế bào, các lớp oxy hoạt hóa (O2-, H2O2), nitơ hoạt hóa (NO), các protein kinase...

Câu 11: Khái niệm và đặc điểm quan hệ gen-đối-gen?

·  Khái niệm

Thực tế, Flor chưa bao giờ đưa ra một định nghĩa rõ ràng về lý thuyết của mình. Năm 1971, tổng kết nghiên cứu của mình và của các tác giả khác, Flor đã viết" đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây ký chủ có một gen tương ứng qui định tính gây bệnh trong ký sinh "For each gene that conditions resistance in the host there is a corresponding gene that conditions pathogenicity in the parasite". Khẳng định này của Flor được sử dụng rộng rãi và được xem là định nghĩa chính thức của Flor về thuyết gen-for-gen.

Vì mối quan hệ gen-đối-gen thường là quan hệ trội-trội trong khi đó "gen qui định tính gây bệnh" thường được hiểu là gen lặn nên định nghĩa trên của Flor dễ gây nhầm lẫn. Do vậy, khái niệm gen-đối-gen của Flor đã được biến đổi một chút cho phù hợp với lý thuyết của ông như sau: "đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây ký chủ có một gen tương ứng qui định tính không độc trong ký sinh và 2 gen này tương tác đặc hiệu với nhau"; "for each gen determining resistance in the host there is a corresponding gen for avirulence in parasite with which it specifically interacts".

Quan hệ gen-đối-gen cho tới nay đã được chứng minh là tồn tại trong rất nhiều loại bệnh do hầu hết các nhóm tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng, mollicute...) gây ra.

Các gen cây ký chủ qui định tính kháng (chú ý không nhất thiết phải tuân theo quan hệ gene-for-gene) được gọi chung là gen R (Resistance). Các gen ký sinh qui định tính không độc của ký sinh được gọi chung là gen Avr (Avirulence). Các ký hiệu R hoặc Avr sẽ được viết thường là r hoặc avr nếu trạng thái của gen là lặn. Các chữ số viết kèm theo (nếu có) cho biết sự tương ứng của các cặp gen. Ngoài qui định chung này, trên mỗi hệ ký sinh-ký chủ, người ta thường sử dụng các ký hiệu riêng. Ví dụ:

            Cây lanh: L2, L5                         <=>     Nấm M. lini: AL2 (hoặc AvrL2), L5 (hoặc AvrL5)

            Cây lúa: Pi-ta                  <=>     Nấm P. oryzae : AvrPi-ta

            Cây lúa: Xa5, Xa21         <=>     Vi khuẩn X. oryzae: AvrXa5, AvrXa21

            Cây cà chua: Cf2, Cf9    <=>     Nấm C. fulvum: Avr2, Avr9

            Cà chua: AvrPto                         <=>     Vi khuẩn P. syringae: Pto

·  Đặc điểm quan hệ gen-đối-gen

          Phần lớn quan hệ gen-đối-gen là quan hệ trội-trội có nghĩa đối với cây ký chủ, gen qui định tính kháng là gen trội (R) còn gen qui định tính mẫn cảm (thiếu tính kháng) là gen lặn (r); đối với ký sinh, gen qui định tính không độc (không có khả năng gây bệnh) là gen trội (Avr) còn gen qui định tính độc là gen lặn (avr). Nói cách khác cả gen kháng của ký chủ và gen không độc của ký sinh đều phải được biểu hiện để tạo ra tính kháng.

          Mỗi gen ký chủ thường nhận biết và tương tác với chỉ gen tương ứng của ký sinh (và ngược lại). Điều này dẫn tới nếu ký chủ có nhiều gen kháng/nhiễm và ký sinh có nhiều gen không độc/độc thì tính kháng chỉ có thể hình thành khi ít nhất có tương tác của một cặp gen tương ứng. Ví dụ:

            Cây (R1, r2, r3) + ký sinh (Avr1, Avr2, Avr3) => kháng

            Cây (R1, r2, r3) + ký sinh (avr1, Avr2, Avr3) => nhiễm

          Số lượng chủng (race) tối đa trong quần thể tác nhân gây bệnh =2n trong đó n là số gen kháng R trong quần thể ký chủ.

          Việc xác định kiểu hình kháng hay nhiễm hoàn toàn dễ dàng khi sử dụng bảng punnett. Khi xây dựng bảng punnett cần chú ý là kiểu gen của cây ký chủ là lưỡng bội còn kiểu gen của ký sinh sẽ hoặc đơn bội hoặc lưỡng bội tùy thuộc loại tác nhân gây bệnh. Ví dụ ký sinh có kiểu gen đơn bội là vi khuẩn, nhiều loại nấm túi (như nấm đạo ôn lúa Pyricularia oryzae); ký sinh có kiểu gen lưỡng bội là tuyến trùng, các loài nấm đảm (như nấm gỉ sắt, than đen...).

          Tính kháng của cây trồng tuân theo quan hệ gen-đối-gen được gọi là tính kháng gen-đối-gen. Tính kháng gen-đối-gen thường là tính kháng đặc hiệu ký chủ, tính kháng đơn gen, tính kháng gen chủ, tính kháng không bền vững.

          Hậu quả của một phản ứng kháng gen-đối-gen thường là phản ứng siêu nhạy/apoptosis.

Câu 12: Đặc điểm Avr gen (Avr protein). Đặc điểm họ gen AvrBs3 của vi khuẩn Xanthomonas. Đặc điểm các Avr gen của nấm và virus.?

Sự tồn tại của các gen Avr và sản phẩm của chúng là các protein Avr đã được chứng minh bằng thực nghiệm dựa trên các thí nghiệm của Flor từ những năm 1940. Cho tới nay, nhiều gen Avr đã được xác định từ nhiều nhóm tác nhân gây bệnh bao gồm nấm, vi khuẩn và virus.

Một số thuật ngữ liên quan hiện đang được sử dụng:

Effector (chất hiệu ứng): là phân tử có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh tác động lên tế bào ký chủ, nhờ đó tạo điều kiện cho sự nhiễm bệnh. Một effector được gọi là elicitor khi nó bị cây nhận biết và khởi động phản ứng phòng thủ.

Elicitor (chất kích hoạt): là phân tử có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh khởi động phản ứng phòng thủ dẫn tới tăng cường tính kháng và được cây nhận biết. Khi sự nhận biết được thực hiện nhờ protein R của cây ký chủ thì elicitor của tác nhân gây bệnh được xem là protein Avr.

Định nghĩa gen Avr

Gen Avr là các gen làm cho tác nhân gây bệnh trở thành không độc khi có mặt gen kháng R của cây ký chủ. Khả năng này của gen Avr có được là do sản phẩm protein của nó cảnh báo tế bào cây ký chủ về sự tấn công của tác nhân gây bệnh và do đó khởi động phản ứng phòng thủ dẫn tới phản ứng siêu nhạy/apoptosis. Như vậy có thể xem protein Avr là elicitor được cây nhận biết thông qua gen kháng R.

Không giống như gen/protein kháng R của cây, nhìn chung, gen/protein Avr của tác nhân gây bệnh chia sẻ ít đặc điểm chung với nhau. Dưới đây là một số đại diện gen/protein Avr.

Họ gen AvrBs3 của vi khuẩn Xanthomonas. Cho tới nay, khoảng 40 gen Avr thuộc họ này đã được xác định từ nhiều loài vi khuẩn Xanthomonas kể cả 1 gen Brg11 của vi khuẩn Ralstonia solanacearum. Các ví dụ về các gen Avr thuộc họ này bao gồm:

X. campestris pv. vesicatoria

AvrBs3, AvrBs4

X. oryzae pv. oryzae

AvrXa5, AvrXa3, AvrXa7, AvrXa10, AvrXa27

X. oryzae pv. oryzicola

Avr/pth3, Avr/pth13, Avr/pth14

X. campestris pv. malvacearum

AvrP6, PthN

X. axonopodis pv. citri

Apl1, Apl2, Apl3, PthA, PthA1, PthA2, PthA3, PthA4, PthB

X. campestris pv. manihotis

PthB

Ralstonia solanacearum

Brg11

Các gen thuộc họ này mã hóa cho các protein chứa khoảng 13 - 23 các chuỗi lặp gồm 34 aa ở vùng trung tâm. Đầu C của các protein này chứa dấu hiệu nhập nhân (Nuclear Localization Signal - NLS) và một vùng hoạt hóa phiên mã (Activated Domain - AD). Cấu trúc này chứng tỏ (đã được chứng minh bằng thực nghiệm) các protein này hoạt động trong nhân và tương tác với quá trình phiên mã của tế bào ký chủ.

Gen AvrPto của vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. tomato (gây bệnh đốm đen vi khuẩn cà chua). Gen này mã hóa protein AvrPto có trọng lượng phân tử thấp khoảng 18 kD và được hệ thống tiết loại 3 của vi khuẩn đưa và trong tế bào chất.

Các gen Avr của nấm. Có khá nhiều gen Avr của nấm đã được phân lập. Một số protein Avr là các protein giàu cystein như AvrCf2 của nấm Cladosporium fulvum; AvrP4; AvrP123 của nấm M. lini. Một số protein Avr được nấm tiết ra ở gian bào (apoplasm) và tương tác với protein R của ký chủ ở bề mặt tế bào; vi dụ như các protein AvrCf2, vrCf4, AvrCf9 của nấm C. fulvum. Một số lại được nấm tiết trực tiếp vào tế bào chất qua vòi hút chẳng hạn như các protein kháng của nấm sương mai, phấn trắng, gỉ sắt.

Các gen Avr của virus. Đối với virus thực vật, các gen Avr thường liên quan đến 1 protein chức năng của virus. Ví dụ điển hình là protein tái sinh (Replication protein) của Tobacco mosaic virus - TMV. Gen Rep của TMV là gen không độc tương ứng với gen kháng N trong cây thuốc lá. Ngoài ra, các protein vỏ (Coat Protein-CP) của virus cũng là gen Avr phổ biến đối với virus.

Một câu hỏi cần đặt ra là tại sao các gen/protein Avr của tác nhân gây bệnh làm giảm khả năng tấn công (mất ưu thế thích nghi) của tác nhân gây bệnh lại vẫn tồn tại trong quần thể tác nhân gây bệnh. Câu trả lời là mặc dù các gen này có thể tương tác (trực tiếp hoặc gián tiếp) với gen kháng thì trong trường hợp không có gen kháng, các gen Avr này vẫn có một số chức năng có lợi cho tác nhân gây bệnh. Ví dụ trên cây cà chua thiếu gen kháng Pto thì gen AvrPto sẽ tạo điều kiện cho sự gây bệnh của vi khuẩn bằng cách ức chế sự phòng thủ vách tế bào cây (thí nghiệm trên cây Arabidopsis). Các nghiên cứu đối với nấm Phytophthora infestans, Puccinia graminis cho thấy, ngay sau khi áp lực chọn lọc bởi gen kháng R của ký chủ bị mất thì các gen Avr tái xuất hiện.

Câu 13: Phân loại 5 lớp gen kháng R (protein R); lấy ví dụ mỗi loại.?

Như đã biết, nhiều loại tác nhân gây bệnh có thể tiếp xúc với cây nhưng nhìn chung cây có thể kháng lại tốt với phần lớn tác nhân gây bệnh. Thậm chí tác nhân có thể tấn công và gây bệnh thì cây vẫn có thể biểu hiện tính kháng với các mức độ khác nhau. Cho tới nay, rất nhiều gen kháng R của cây đã được xác định. Các gen kháng này có thể qui định tính kháng thông qua quan hệ gen-đối-gen hoặc không. Sản phẩm của các gen này gọi là các protein kháng R

Phân loại protein kháng R. Hiện nay, các protein kháng R được chia thành 5 lớp dựa trên đặc điểm cấu trúc và vị trí hoạt động của chúng trong tế bào ký chủ. Các protein trong cùng lớp nhìn chung khá bảo thủ.

1.1.  Pto

Lớp protein thứ nhất chỉ gồm 1 thành viên là Pto phân lập từ cà chua. Pto có 1 vùng có hoạt tính xúc tác kinase. Pto là gen kháng hoạt động trong tế bào chất. Pto là protein kháng chống vi khuẩn P. syringae pv. tomato mang gen AvrPto. Pto có hoạt tính kinase điều khiển dẫn truyền tín hiệu trong tế bào chất dẫn tới phản ứng siêu nhạy.

1.2.  CNL (CC-NB-LRR)

Lớp protein kháng thứ hai gồm một số lượng lớn protein có cấu trúc gồm (1) một vùng khóa kéo leucine (leucine-zipper - LZ) hoặc một chuỗi xoắn kép (coiled-coil - CC) ở đầu amin; (2) một vùng có khả năng liên kết nucleotide (nucleotide binding - NB) ở vùng trung tâm; và (3) một vùng lặp giàu leucine (leucine-rich repeats - LRR) phía đầu carboxyl. Các protein của lớp này hoạt động trong tế bào chất. Các ví dụ về protein lớp CNL trình bày ở Bảng 2.

1.3.  TNL (TIR-NB-LRR)

Lớp protein kháng thứ ba là lớp có số lượng lớn nhất và chỉ có ở cây 2 lá mầm. Về cấu trúc, lớp protein TNL tương tự lớp CNL nhưng thay vì chuỗi CC là một chuỗi TIR. Chuỗi TIR là một vùng protein tương đồng với receptor Toll (của ruồi dấm) và receptor Interleukin-1 (của người) (TIR = Toll/Interleukin-1 Receptor). Tương tự protein kháng lớp CNL, các protein của lớp TNL cũng hoạt động trong tế bào chất. Các ví dụ về protein lớp TNL trình bày ở Bảng 2.

Cả 2 lớp CNL và TNL còn được xếp vào chung một họ protein kháng gọi là họ NB-LRR. Số lượng gen kháng của họ này đươc xem là chiếm số lượng lớn nhất trong các họ protein (Ví dụ trên lúa có hơn 400 gen; Arabidopsis có 150 gen).

Đối với cả 2 lớp, đầu amin (chứa vùng CC hoặc TIR) chịu trách nhiệm tương tác với phân tử được bảo vệ - guardee (xem phần 1.5) hoặc với các phân tử phía hạ lưu của đường hướng dẫn truyền tính kháng. Phần trung tâm là vùng NBS có khả năng liên kết và thủy phân ATP và do đó chịu trách nhiệm khởi động đường hướng dẫn truyền tín hiệu. Ở đầu carboxyl, chuỗi LRR chịu trách nhiệm qui định tính đặc hiệu đối với elicitor mặc dù phần lớn là gián tiếp.

1.4.  Cf

Lớp protein kháng thứ tư là một số các protein Cf phân lập từ cà chua như Cf2, Cf4, Cf5, Cf9 qui định tính kháng với nấm Cladosporium fulvum mang các gen Avr tương ứng là AvrCf2, AvrCf4, AvrCf5, AvrCf9. Các protein này thiếu vùng NB; không có hoạt tính kinase. Các prtein nhóm này là các protein xuyên màng với vùng LRR nằm bên ngoài (trên bề mặt tế bào).

1.5.  Xa21

Lớp protein kháng thứ 5 chỉ có protein Xa21 phân lập từ lúa. Protein Xa21 là một protein xuyên màng, có một vùng LRR  nằm bên ngoài (trên bề mặt tế bào) và một vùng kinase nằm bên trong tế bào chất.

Một số protein R không thuộc 5 lớp trên gồm:

          Hml là một enzyme khử độc và kháng nấm Cochlibolus trên ngô.

          Mlo là một protein màng tế bào lúa miến (barley) mà các đột biến lặn của nó qui định tính kháng nấm phấn trắng và có lẽ điều khiển âm các phản ứng phòng thủ.

          RPW8 là protein phân lập từ cây Arabidopsis qui định tính kháng nấm phấn trắng theo kiểu không đặc hiệu chủng. PRW8 cũng là một protein xuyên màng.

Câu 14: Hai loại tương tác của Avr và  R protein (lấy 1 ví dụ mỗi loại)?

·   Tương tác trực tiếp - mô hình Elicitor - Receptor

Quan hệ gen-đối-gen lúc đầu đã được giả thiết là dựa trên tương tác trực tiếp giữa protein R và Avr protein. Sự tương tác này được gọi là mô hình Elicitor - Receptor, trong đó elicitor là các protein Avr đóng vai trò là chất kích hoạt còn receptor các protein kháng đóng vai trò là chất tiếp nhận. Phản ứng kháng hình thành chỉ khi có sự tương tác trực tiếp giữa elicitor và receptor. Hiện nay, sự tương tác trực tiếp giữa 2 thành phần này mới chỉ được chứng minh là đúng trên một số ít trường hợp, tất cả đều liên quan đến các protein kháng lớp TIR/CC-NBS-LRR. Dưới đây là các trường hợp có tương tác trực tiếp.

            Tương tác giữa protein AvrPi-ta (của nấm Pyricularia oryzae) và protein Pi-ta (lúa).

Lúa      ó   Nấm Pyricularia oryzae

Pi-ta     ó              AVR-Pita          

            Tương tác giữa AvrL567 (của nấm M. lini) và các protein L5, L6, L7 (họ các protein kháng thuộc locus L của cây lanh).

            Tương tác giữa AvrPopP2 (của vi khuẩn R. solanacearum) và protein RRS1 (của Arabidopsis).

            Tương tác trực tiếp giữa: FLS2 (của cây) và Fgl22 (của lông roi vi khuẩn Gram -).

Mô hình tương tác trực tiếp không thể giải thích được tại sao chỉ với một số gen kháng, cây trồng có thể nhận biết được một số lượng lớn các effector của tác nhân gây bệnh.

·   Tương tác gián tiếp - mô hình bảo vệ (Guard model)

Sự tương tác giữa gen kháng R và Avr để dẫn tới phản ứng kháng gần đây đã được chứng minh chủ yếu thực hiện theo cách gián tiếp gọi là "mô hình bảo vệ". Theo mô hình này, protein kháng R của ký chủ sẽ liên kết và "bảo vệ" một protein A. Protein được bảo vệ (guardee) này sẽ tương tác với protein Avr của tác nhân gây bệnh và hoạt hóa protein R dẫn tới kích hoạt các phản ứng dẫn tới tính kháng. Thực sự protein kháng R của cây không phát hiện protein Avr mà phát hiện hoạt động của nó có nghĩa nếu protein Avr khi có mặt trong tế bào mà không hoạt động tức không tương tác, thường thông qua hoạt tính enzyme của nó đối với phân tử được bảo vệ, thì protein kháng R sẽ không phát hiện.

Mô hình bảo vệ giải thích được tại sao chỉ với một số gen kháng, cây trồng có thể nhận biết được một số lượng lớn các effector của tác nhân gây bệnh. Mô hình này đã được chứng minh bằng thực nghiệm trên nhiều trường hợp. Dưới đây là một số ví dụ:

            AvrPphB của vi khuẩn P. syringae và protein kháng RPS5 của cây Arabidopsis. AvrPphB là một protease nhóm cystein. Sau khi được vi khuẩn đưa vào trong tế bào cây, AvrPphB sẽ cắt một phân tử protein kinase của ký chủ là PBS1. Protein kháng RPS5 sẽ nhận biết được việc cắt này và khởi động phản ứng kháng.

            AvrRpm1 (hoặc AvrB) của vi khuẩn P. syringae và protein kháng RPM1 của cây Arabidopsis. Khi được đưa vào trong tế bào, AvrRpm1 (hoặc AvrB) sẽ  phosphoryl hóa một protein của ký chủ là RIN4. Protein kháng RPM1 giám sát hiện trạng của RIN4 và do đó nhận biết sự phosphoryl hóa của RIN4 và khởi động phản ứng phòng thủ.

Arabidopsis      ó      Pseudomonas syringae

      RPM1 / RIN4    ó              AVR-Rpm1

Gen kháng   Guardee

Câu 15: Liệt kê cơ chế tạo tính đa dạng của nấm, vi khuẩn và virus. Các lực chính điều khiển sự tiến hóa của tác nhân gây bệnh (rào cản địa lý và cây ký chủ)?

· Cơ chế tạo tính đa dạng của nấm:

            Nấm - Sinh sản hữu tính

Nấm và vi sinh vật giống nấm gây bệnh cây được phân loại thành các ngành (Division) khác nhau trên cơ sở sinh sản hữu tính, ví dụ Ngành Nấm Trứng (Oomycota) (ví dụ như Phytophthora) sinh sản hữu tính tạo bào tử trứng (oospore); Ngành Nấm Đảm (Basidiomycota) (ví dụ như các loại nấm gỉ sắt) sinh sản hữu tính tạo bào tử đảm (basidiospore); Ngành Nấm Túi (Ascomycota) (ví dụ như nấm đạo ôn lúa Magnaporthe oryzae) sinh sản hữu tính tạo bào tử túi (ascospore).

Trong quá trình sinh sản hữu tính, nấm có thể trao đổi vật liệu di truyền thông qua tái tổ hợp dẫn tới kiểu hình (kể cả các tính trạng kháng bệnh) của con cháu khác với bố mẹ.

Nấm sinh sản hữu tính nhờ sự tương hợp hữu tính (sexual compatibility) và được điều khiển bởi các gen qui định kiểu ghép cặp (mating type) khác nhau. Nếu sự sinh sản hữu tính được thực hiện từ 2 cá thể khác nhau thì nấm được gọi là loài dị tản (heterothallic). Ví dụ nấm Phytophthora infestans là một loài dị tản, có 2 kiểu ghép cặp ký hiệu là A1 và A2. Chỉ khi 2 mẫu nấm P. infestans độc lập (dị tản) có kiểu ghép cặp khác nhau mới có thể sinh sản hữu tính. Nếu sự sinh sản hữu tính được thực hiện từ cùng một cá thể (tự thụ) thì nấm được gọi là loài đồng tản (homothallic). Chú ý sinh sản hữu tính đồng tản không được điều khiển bởi gen qui định kiểu ghép cặp và cũng không tạo ra sự đa dạng di truyền.

 Sự giao phối chéo (intersterility) khác loài chỉ xảy ra đối với nấm đảm và cũng chỉ xảy ra giữa các loài khá đồng nhất về di truyền. Sinh sản cận tính (parasexuality), thường được định nghĩa chính thức là một hình thức sinh sản hữu tính trong loài,  nhưng cũng có thể xảy ra giữa các loài có quan hệ gần gũi như đã được chứng minh đối với một số loài nấm trứng như Phytophthora. Chú ý trong sinh sản cận tính khác loài, có sự trao đổi và tái tổ hợp vật liệu di truyền nhưng không có phân bào giảm nhiễm (meiosis). Nhiều loài nấm Phytophthora thường phát hiện thấy cùng gây bệnh trên một cây và việc giao phối cận tính có thể xảy ra, nhưng con lai thường bất dục. vi dụ chỉ khoảng 4-5% con lai giữa P. palmivora và  P. cinnamomi có khả năng sinh bào tử trứng.

Sư trao đổi vật liệu di truyền thông qua sinh sản có nghĩa từ thế hệ bố mẹ sang thế hệ con cháu được gọi là chuyển gen theo chiều dọc (vertical gene transfer).

            Nấm - chuyển gen theo chiều ngang

Cho tới nay, nhiều bằng chứng cho thấy nấm có khả năng chuyển vật liệu di truyền không thông qua sinh sản giữa các cá thể trong loài và khác loài. Sự di chuyển vật liệu di truyền theo kiểu này được gọi là chuyển gen theo chiều ngang (horizontal gene transfer). Sự chuyển gen theo chiều ngang có thể thực hiện thông qua plasmid (vd plasmid của nấm Neurospora; chú ý plasmid của nấm thường là dạng sợi thẳng, kích thước khoảng 2-10 kb); virus (ví dụ virus của nấm Rhizoctonia solani)...

            Nấm - Đột biến.

Đối với nấm, ngoại trừ nấm đảm, thì giai đoạn vô tính và sinh sản vô tính chiếm ưu thế trong chu kỳ phát triển. Nhiều loài thậm chí giai đoạn hữu tính không xảy ra trong tự nhiên (ví dụ như đối với nấm đạo ôn lúa Magnaporthe oryzae). Như vậy đột biến là một cơ chế quan trọng dẫn tới sự đa dạng của nấm.

· Các lực chính điều khiển sự tiến hóa của tác nhân gây bệnh:

Trong di truyền quần thể, nhìn chung, người ta xét 5 lực tiến hóa có ảnh hưởng tới cấu trúc di truyền của quần thể tác nhân gây bệnh. Các lực này là: đột biến, trôi dạt di truyền, dòng gen, hệ thống ghép cặp và chọn lọc tự nhiên. Chúng ta xét 2 yếu tố quan trọng liên quan đến chọn lọc tự nhiên là sự biệt lập địa lý và cây ký chủ.

Rào cản địa lý. Rào cản địa lý là một yếu tố quan trọng điều khiển sự tiến hóa của tác nhân gây bệnh. Nhiều loài/chủng tác nhân gây bệnh chỉ có mặt ở vùng này mà không có mặt ở vùng khác. Ngoài ra, đặc điểm ngoại cảnh và ký chủ khác biệt nhau giữa các vùng địa lý cũng đóng góp vào yếu tố điều khiển này. Hậu quả của rào cản địa lý là hình thành nên các loài/chủng đặc trưng cho từng vùng địa lý. Ví dụ quần thể vi khuẩn bạc lá của Trung quốc khác Việt Nam dẫn tới nhiều giống lúa lai Trung Quốc, vốn kháng rất tốt bệnh bạc lá tại Trung Quốc, đã không thể kháng được quần thể vi khuẩn bạc lá của Việt Nam.

Cây ký chủ. Đây là một trong các yếu tố chính điều khiển sự tiến hóa của quần thể tác nhân gây bệnh trong một vùng địa lý xác định. Cây ký chủ và tính kháng của nó có thể tác động đến sự tiến hóa của tác nhân gây bệnh ở mức loài hoặc dưới loài. Ví dụ,đã có bằng chứng cho thấy 3 loài nấm P. mirabilis, P. ipomoeae, và P. infestans tiến hóa từ một tổ tiên chung và nhiễm trên 3 họ thực vật hoàn toàn khác nhau. Ở mức dưới loài, hậu quả của tương tác giữa tác nhân gây bệnh với các loài/giống cây ký chủ khác nhau đã dẫn tới hình thành các khái niệm chủng sinh lý (race), dạng chuyên hóa (forma specialis, số ít), biovar, pathovar...của tác nhân gây bệnh (chú ý, đây là các khái niệm phân loại không chính thức dưới loài và khác nhau tùy theo đối tượng nghiên cứu). Ví dụ đối với loài nấm Fusarium oxysporum, hàng chục dạng chuyên hóa (formae speciales, số nhiều) được phân biệt trên cơ sở tính gây bệnh héo với các loài ký chủ khác nhau, Vd: Fusarium oxysporum f.sp. asparagi (măng tây); f.sp. cubense (chuối); f.sp. dianthi (cẩm chướng); f.sp. lycopersici (cà chua); f.sp. niveum (dưa hấu); f.sp. tracheiphilum (đậu tương). Trong mỗi một dạng chuyên hóa, các tác nhân gây bệnh có thể phân nhóm lại thành các race trên cơ sở tính gây bệnh trên các giống cây khác nhau; ví dụ F. oxysporum f.sp. cubense gây bệnh trên chuối gồm 4 race (1,2,3,4). Tương tự, loài vi khuẩn R. solanacearum gồm 5 race được phân biệt dựa trên tính gây bệnh trên các cây ký chủ khác nhau.

Câu 16: Quan hệ đồng tiến hóa giữa gen Avr và R?

· Đồng tiến hóa trong sản xuất nông nghiệp

Trong sản xuất nông nghiệp, người ta thường tạo các giống cây đồng nhất về di truyền, mang tính kháng đặc hiệu chủng. Tuy nhiên, sau một vài năm, tính kháng bị bẻ gẫy. Để duy trì năng suất, người ta lại thay một giống khác mang gen kháng mới và sau một vài năm, tính kháng lại bị mất. Hiện tượng tính kháng bị mất là do trong quần thể tác nhân gây bệnh đã xuất hiện các đột biến tự phát khắc phục được tính kháng.

Việc đưa liên tục các giống kháng mới đã gây ra sự đồng tiến hóa nhân tạo giữa giống kháng đặc hiệu chủng và tác nhân gây bệnh độc đặc hiệu hình thành tự phát. Các lực điều khiển sự đồng tiến hóa này là (i) tốc độ sinh sản và đột biến cao của tác nhân gây bệnh và (ii) việc đưa liên tục các giống kháng mới vào sản xuất.

Quá trình đồng tiến hóa giữa cây trồng và tác nhân gây bệnh gồm nhiều bước:

Giả sử đầu tiên là giống A có kiểu gen r1/r2/rn hoàn toàn bị nhiễm bệnh đối với tác nhân gây bệnh B có kiểu gen Avr1/Avr2/Avrn. Bước đầu tiên là đưa 1 gen kháng R1 vào giống A để có giống kháng R1 có kiểu gen R1/r2/rn. Sự nhận biết đặc hiệu giữa sản phẩm của gen R1 (ký chủ) và Avr1 (ký sinh) đã tạo ra sự kháng bệnh. Bước thứ 2 là sự chọn lọc các cá thể ký sinh mang đột biến tự phát avr1/Avr2/Avrn. Do các cá thể mang đột biến tự phát này mất yếu tố không độc qui định bởi gen Avr1 nên không bị yếu tố kháng qui định bởi gen R1 nhận biết dẫn tới có khả năng gây bệnh trên giống kháng tạo ra ở bước 1. Bước thứ 3, tương tự bước thứ nhất, là tạo ra giống kháng mới mang gen kháng R2 (có kiểu gen R1/R2/rn. Giống kháng này có thể kháng lại chủng tác nhân gây bệnh có kiểu gen avr1/Avr2/Avrn do có sự nhận biết giữa sản phẩm của gen R2 (ký chủ) và Avr2 (ký sinh). Bước thứ 4, tương tự bước thứ 2, là sự chọn lọc các đột biến tự phát các cá thể có kiểu gen avr1/avr2/Avrn hình thành trong quần thể tác nhân gây bệnh. Như vậy sự đồng tiến hóa giữa giống kháng và tác nhân gây bệnh độc trong sản xuất nông nghiệp là cuộc đua không có điểm dừng giữa việc đưa giống kháng mới và sự hình thành - chọn lọc các cá thể độc trong quần thể tác nhân gây bệnh.

Một số điểm chú ý:

Sự hình thành đột biến độc trong quần thể tác nhân gây bệnh không độc ở bước 2 và 4 vốn, về lý thuyết, không thể nhân lên trong quần thể cây kháng là do 1 trong 2 khả năng: (i) đột biến có thể được mang từ nơi khác tới hoặc (ii) đột biến hình thành tại chỗ nếu quần thể tác nhân gây bệnh không độc có thể gây bệnh ở mức độ yếu.

Thời gian tồn tại của giống kháng có thể kéo dài nếu đưa 2 hoặc nhiều gen kháng vào giống kháng. Giống cây càng mang nhiều gen kháng thì cơ hội cho tác nhân gây bệnh không độc có đột biến đồng thời khắc phục tất cả các gen kháng này càng thấp. Tuy nhiên việc tạo giống vừa mang nhiều gen kháng chủ vừa duy trì các tính trạng nông học tốt không dễ dàng.

· Đồng tiến hóa trong hệ sinh thái tự nhiên

Trong hệ sinh thái tự nhiên, cơ chế đồng tiến hóa giữa ký sinh - ký chủ cũng tương tự như trong sản xuất nông nghiệp. Tuy nhiên biểu hiện và hậu quả của sự đồng tiến hóa này có nhiều điểm khác biệt:

Trong hệ sinh thái tự nhiên, tác nhân gây bệnh gây ít thiệt hại hơn nhiều đối với cây so với hệ sinh thái trồng trọt. Các gen kháng đặc hiêu hình thành tự phát trong quần thể cây và sự bền vững của nó chủ yếu bị ảnh hưởng bởi mức độ đa hình của chính nó cũng như sự cân bằng giữa các đột biến độc/không đôc trong quần thể tác nhân gây bệnh. Các yếu tố này thường dẫn tới trạng thái cân bằng về tính kháng của ký chủ và và tính gây bệnh của ký sinh. Trạng thái cân bằng này đảm bảo sự tồn tại của cả cây và tác nhân gây bệnh.

Trạng thái cân bằng giữa ký sinh - ký chủ trong hệ sinh thái tự nhiên có được là do quần thể tác nhân gây bệnh cũng như cây không có kiểu gen đồng nhất trên môt diện tích lớn. Trên một diện tích lớn, chúng thường tồn tại dưới dạng cái gọi là siêu quần thể (metapopulation). Một siêu quần thể gồm nhiều quần thể phụ có đặc trưng kháng/độc khác nhau. Do vậy nếu sự cân bằng về tính kháng (ký chủ)/tính độc (ký sinh) tại một quần thể phụ bị phá vỡ thì một cân bằng mới dễ dàng được thiết lập do sự di chuyển của tác nhân gây bệnh cũng như sự chuyển gen của cây ký chủ thông qua giao phấn hoặc phát tán hạt từ các quần thể phụ lân cận.

Câu 17: Đặc điểm miễn dịch bẩm sinh và tính kháng không đặc hiệu của thực vật đối với tác nhân VSV. Lấy ví dụ 2 loại PAMP/MAMP của tác nhân VSV?

·    Đặc điểm miễn dịch bẩm sinh thực vật:

            Trong đời sống của mình, cây bị tấn công bởi nhiều loại tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên chỉ một số lượng rất nhỏ các tác nhân này có khả năng gây bệnh cho cây.

            Thực vật thiếu một cơ chế miễn dịch thích nghi và di động như ở động vật. Hiện nay, nhiều bằng chứng cho thấy thực vật cũng tồn tại một cơ chế miễn dịch bẩm sinh. Điểm giống nhau cơ bản giữa miễn dịch bẩm sinh của động vật và thực vật là sự nhận biết giữa các receptor của tế bào và các MAM/PAMP của tác nhân gây bệnh.

            Một trong những định nghĩa của tính kháng hay miễn dịch bẩm sinh là "hệ thống giám sát nhằm phát hiện sự có mặt và bản chất của sự xâm nhiễm và tạo ra phòng tuyến phòng thủ của ký chủ. Như vậy miễn dịch bẩm sinh dựa vào khả năng nhận biết của cây đối với ký sinh mà sự nhận biết này có thể trực tiếp hoặc gián tiếp.

            Hiển nhiên miễn dịch bẩm sinh được điều khiển bởi đặc trưng di truyền của ký chủ và là một hệ thống phòng thủ nhiều lớp. Ngay khi vượt qua được lớp rào cản vật lý bên ngoài (bề mặt cây), tác nhân gây bệnh sẽ gặp phải hệ thống cảnh báo là các phân tử receptor trên bề mặt tế bào.

            Khác với động vật, ở thực vật, miễn dịch bẩm sinh bao gồm cả 2 loại đặc hiệu và không đặc hiệu. Dựa vào mức độ đặc hiệu miễn dịch (hay tính kháng) bẩm sinh của cây có thể được chia thành 2 loại là tính kháng không đặc hiêu (tính kháng chung) và tính kháng đặc hiệu.

·    Tính kháng không đặc hiệu của thực vật đối với tác nhân VSV:

            Tính kháng không đặc hiệu hay tính kháng chung có thể được định nghĩa là tính kháng mà tất cả các thành viên (dòng/giống) của một loài cây kháng được tất cả các thành viên (chủng/nòi) của một loài tác nhân gây bệnh.

            Cần chú ý là tính kháng không đặc hiệu còn được gọi là tính kháng cơ bản (basic resistance). Nếu tính kháng cơ bản hình thành từ mối quan hệ tương tác khác dạng (ví dụ như giữa nấm Pyricularia và cây ngô) thì mức độ kháng rất cao hay miễn dịch. Trái lại, nếu tính kháng cơ bản hình thành từ mối quan hệ tương tác cùng dạng (ví dụ giữa nấm đạo ôn và cây lúa) thì mức độ kháng thường thấp (tính kháng ngang) vì tác nhân gây bệnh đã đưa vào trong tế bào nhiều effector ức chế tính kháng cơ bản của cây.

            Về mặt tiến hóa, tính kháng không đặc hiệu cổ hơn tính kháng đặc hiệu.

            Tính kháng không đặc hiệu hình thành dựa trên khả năng của cây nhận biết được các các elicitor chung (general elicitor) của tác nhân gây bệnh. Hiện nay, các elicitor này được gọi là các PAMP (Pathogen-Associated Molecular Pattern). Thuật ngữ PAMP do các nhà nghiên cứu miễn dịch động vật sử dụng đầu tiên và đang dần bị thay thay thế bởi thuật ngữ MAMP (Microbe Associated Molecular Pattern) vì người ta thấy rằng các vi sinh vật không gây bệnh cũng có các PAMP giống như của tác nhân gây bệnh.

            Các PAMP/MAMP nhìn chung đa dạng về bản chất hóa học, thường là các chuỗi peptide, glycoprotein, lipids và oligosaccharides có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh và không gây bệnh.

            Điểm chú ý là trong quá trình gây bệnh, các tác nhân gây bệnh, thông qua các hoạt động enzyme thủy phân, cũng tạo ra các chất có nguồn gốc từ vách tế bào thực vật mà các chất này cũng đóng vai trò như elicitor kích hoạt phản ứng phòng thủ của cây. Các chất có nguồn gốc từ ký chủ như trên được gọi là các mô hình phân tử (có nguồn gốc ký chủ) được cảm ứng bởi tác nhân gây bệnh và được ký hiệu là MIMPs (Microbe-Induced Molecular Patterns). Như vậy cây không chỉ nhận biết và phản ứng với các dấu hiệu có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh mà còn có nguồn gốc từ chính cây.

Các PAMP/MAMP hiển nhiên khá bảo thủ trong một nhóm tác nhân gây hại. Một số các MAMP/PAMP chung nổi tiếng là:

§ Lypopolysaccharide (LPS). LPS có nguồn gốc từ các vi khuẩn gram (-) như Xanthomonas, Pseudomonas...LPS cảm ứng để tạo ra sự cháy oxy hóa, hình thành các enzyme kháng sinh.

§ Flagellin. Là protein cấu tạo nên lông roi vi khuẩn gram (-). Mỗi lông roi bao gồm hàng ngàn tiểu phần flagellin. Flagellin chứa một motif nhận biết gồm 22 aa (đoạn fgl22). Flagellin có thể cảm ứng tạo để hình thành callose và các phản ứng phòng thủ khác như hình thành PR protein.

§ Harpin. Harpin là các protein được mã hóa bởi gen hrp (viết tắt của hypersensitive response and pathogenicity) của vi khuẩn gram (-). Phần lớn các loài vi khuẩn có 2 cum gen hrp. Cụm lớn gồm 6-9 đơn vị phiên mã, mỗi đơn vị mã hóa 1-9 protein. Các protein harpin nằm trên màng tế bào vi khuẩn, tham gia cấu tạo nên hệ thống tiết loại III của vi khuẩn. Hệ thống tiết loại III sẽ vận chuyển Avr protein và cả harpin vào trong tế bào cây. Harpin cảm ứng để tạo phản ứng siêu nhạy/apoptosis và các phản ứng phòng thủ khác.

§ Chitin. Chitin là các phân tử oligomer có nguồn gốc từ vách tế bào nấm. Chitin có thể cảm ứng hình thành phytoalexin và lignin hóa tế bào cây.

§ Glucan. Glucan có nguồn gôc từ vách tế bào nấm, đặc biệt là nấm trứng như Phytophthora. Glucan có thể cảm ứng cây hình thành phytoalexin.

§ Glycoprotein. Glicoprotein có nguồn gốc từ vách tế bào nấm trứng như Phytophthora. Glycoprotein có thể cảm ứng cây hình thành phytoalexin.

Câu 18: Đặc điểm nhận biết và tương tác giữa các protein R và PAMP/ MAMP/ Effector?

·   Các receptor nhận biết PAMP/MAMP/Avr protein: Các receptor này thường được phân nhóm thành (i) các receptor nhận biêt PAMP/MAMP (đối với tính kháng không đặc hiệu)  và (ii) các protein R (đối với tính kháng gen-for-gen). Các receptor nhận biết các MAMP/PAMP thường là các protein xuyên màng và có vùng lặp giàu leucin nằm phía bên ngoài tế bào. Tuy nhiên, cơ sở cho việc phân chia này không phải lúc nào cũng rõ ràng, vì vậy người ta có thể gộp chung cả 2 nhóm thành protein kháng R.

· Nhận biết và tương tác giữa các protein R và PAMP/MAMP/Effector:

Sự nhận biết và tương tác này tuân theo 1 trong 2 cơ chế trực tiếp hoặc gián tiếp (xem lại phần tương tác trực tiếp và tương tác gián tiếp).

Vai trò của Effector (chất hiệu ứng): Như đã biết, effector là phân tử có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh tác động lên tế bào ký chủ, nhờ đó tạo điều kiện cho sự nhiễm bệnh.

Đối với cây, sự nhận biết các elicitor chung (MAMP/PAMP) đã hình thành tính kháng cơ bản. Tính kháng này còn được gọi là tính kháng khởi động bởi MAMP/PAMP. Tính kháng này có thể hiệu quả dẫn tới cây không bị bệnh.

Tuy nhiên, tác nhân gây bệnh có thể khắc phục tính kháng cơ bản bằng cách tiết vào tế bào cây các effector. Một vi khuẩn gây bệnh (vd Pseudomonas syringae) trong quá trình gây bệnh có thể tiết vào trong tế bào thực vật từ 20 -30 effector khác nhau thông qua hệ thống tiết loại III. Tương tự, các loại nấm biotroph cũng tiết vào tế bào cây nhiều effector thông qua vòi hút (haustorium) hình thành bên trong tế bào (vd nấm gỉ sắt cây lanh M. lini tiết vào tế bào tới 21 loại effector khác nhau). Nhiều effector của tác nhân gây bệnh có hoạt tính enzym, có vai trò biến đổi các protein của ký chủ nhằm tạo điều kiện cho sự gây bệnh và làm mất khả năng nhận biết của cây. Một trong các vai trò của các effector này là ức chế phản ứng phòng thủ của cây thông qua nhận biết PAMP/MAMP. Một số các protein của virus thực vật (Vd: HP = Helper Component) của các potyvirus) có khả năng ức chế phản ứng phòng thủ của cây thông qua cơ chế gene silencing cũng có thể được xem là effector của virus. Nếu hoạt động của các effector này hiệu quả, cây sẽ bị nhiễm bệnh.

2        Các effector của tác nhân gây bệnh được nghiên cứu nhiều nhất là các Avr protein. Nếu cây có gen R có thể nhận biết được các Avr protein thì một lớp phản ứng kháng thứ 2 sẽ hình thành và  được gọi là tính kháng khởi động bởi effector. Tính kháng khởi động bởi effector hiển nhiên là đặc hiệu và thường tuân theo quan hệ gen-đối-gen.

Câu 19: Đặc điểm dẫn truyền tín hiệu SA và JA/ET trong hình thành tính kháng (chỉ cần lấy 2 ví dụ mỗi loại để chứng minh mỗi đường hường). Quan hệ giữa 2 đường hướng.?

Phản ứng phòng thủ tạo được của cây điều khiển bởi một mạng lưới các đường hướng dẫn truyền tín hiệu chồng chéo lên nhau. Nhiều phân tử tham gia các đường hướng dẫn truyền tín hiệu.

·  Đường hướng salicyclic acid (SA)

Salicyclic acid (SA) là một phytohormon, có vai trò quan trọng trong phát triển, quang hợp, hô hấp... của thực vật.

SA cũng là một phân tử tín hiệu nội sinh tham gia cảm ứng tính kháng tạo được của thực vật. Vai trò của SA trong dẫn truyền tính kháng đã được chứng minh trong một số thí nghiệm:

Xử lý SA trên cây thuốc lá đã dẫn tới giảm triệu chứng bị nhiễm bởi TMV và  tích lũy nhiều PR protein (thí nghiệm của White, 1970).

Lây nhiễm TMV trên thuốc lá dẫn tới hàm lượng SA tăng cục bộ (tại vị trí lây nhiễm) và hệ thống (toàn cây).

Cây Arabidopsis chuyển gen NahG (naphthalene hydroxylase G) của vi khuẩn Pseudomonas putida (là gen mã hóa salicylate hydroxylase, một enzyme chuyển SA thành dạng bất hoạt là catechol) đã biểu hiện tính mẫn cảm cao đối với nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau như nấm, vi khuẩn và virus.

Cây chứa các đột biến mất khả năng tích lũy SA như eds4, eds5 (enhanced disease susceptibility), sid1, sid2 (SA induction-deficient), pad4 (phytoalexin-deficient) biểu hiện tính mẫn cảm cao với tác nhân gây bệnh.

SA tương tác với catalase - là một enzyme xúc tác cho sự phân hủy H2O2 thành H2O và O2. H2O2  là phân tử hoạt động phía thượng lưu của quá trình dẫn truyền tín hiệu. Phía hạ lưu của đường hướng dẫn truyền tín hiệu (phía sau SA) là một protein gọi là NPR1 (non-expressor of PR1 protein) cần cho dẫn truyền SA. Sản phẩm cuối cùng của đường hướng dẫn truyền SA là các loại PR protein, trong đó quan trọng nhất là protein nhóm PR1.

Đường hướng dẫn truyền SA thường do các tác nhân gây bệnh nhóm biotroph gây ra. Nhìn chung các tác nhân gây bệnh này sinh trưởng trong gian bào và nhân lên trong mô nhiều ngày trước khi gây chết hoại mô.

·  Đường hướng dẫn truyền JA và ET

            Jasmonic acid (JA) và ethylen (ET) cũng là các phytohormon. Cả JA và ET đã được chứng minh có vai trò trong tính kháng bệnh như trong các ví dụ sau:

Cây Arabidopsis mang đột biến mất khả năng hình thành JA như fad3/fad7/fad8 (3 đột biến gen fatty acid desaturase) hoặc mất khả năng tiếp nhận JA như coi1 (coronatine insensitive 1) hoặc kháng JA như jar1 (jasmonic acid resistant1) biểu hiện tính mẫn cảm đối với một loạt tác nhân  gây bệnh như nấm Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea, Pythium, vi khuẩn Erwinia carotovora.

Cây Arabidopsis mang đột biến trơ với ET như ein2 (ethylene insensitive2) biểu hiện tính mẫn cảm với nấm  B. cinerea và vi khuẩn  E. carotovora.

Xử lý JA hoặc ET đã dẫn đến là cây biểu hiện gen PDF1-2 (mã hóa protein phòng thủ là defensin) và Thi2-1 (mã hóa protein phòng thủ là thionin), hel (hevein-like protein) và chib (chitinaseB). Các gen này được xem là dấu hiệu phổ biến của đường hướng dẫn truyền JA/ET.

Đường hướng JA/ET có nhiều điểm khác với đường hướng SA: (1) JA/ET hình thành chủ yếu do nhóm necrotroph như nấm Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea, Pythium, vi khuẩn Erwinia carotovora. Các tác nhân này giết chết nhanh chóng tế bào cây để hấp thu dinh dưỡng; (2) sự tích lũy JA và ET có thể hình thành do tác nhân gây bệnh, nhưng cũng có thể hình thành từ các tổn thương do côn trùng .

Câu 20: Đặc điểm của dòng thác ion và sự đốt cháy oxy hóa trong tương tác ký sinh - ký chủ?

Trên màng tế bào ký chủ có các receptor ngoại bào (ví dụ như FLS2). Ngay sau khi cây ký chủ nhận biết được sự có mặt của tác nhân gây bệnh tại màng tế bào, có sự thay đổi về dòng ion đi vào/ra tế bào qua kênh ion dẫn tới thay đổi cân bằng K+/H+ của màng (dòng Ca2+ và H+ vào tế bào tăng, dòng K+ và Cl- ra khỏi tế bào tăng). Phản ứng lại sự thay đổi này là sự hoạt hóa các protein liên kết màng như kinase, phosphatase, phospholipase và protein G. Các kinase sẽ hoạt hóa NADPH oxidase để chuyển O2 thành các lớp oxy hoạt hóa (ROS= reactive oxygen classes) như H2O2, O2-, HO2. Ngoài ra, các kinase cũng hoạt hóa nitric oxydase để tổng hợp nitric oxide (NO) khi sử dụng năng lượng từ NADPH.

Các lớp oxy hóa khử (đặc biệt là H2O2) và NO sẽ ảnh hưởng đến tính kháng bằng 2 cách:

6        ROS, đặc biệt là H2O2,  sẽ hoạt động trên màng/vách. ROS có thể cảm ứng quá trình lignin hóa vách tế bào hoặc liên kết các hợp chất của vách tế bào (crosslinking). ROS cũng có thể oxy hóa các hợp chất đặc biệt là lipid của màng tế bào, ví dụ tạo thành các lipid hydroperoxide là các chất độc đối với tế bào. ROS cũng có thể oxy hóa các hợp chất phenolic thành các chất quinon độc với tế bào. Hậu quả là tế bào bị chết nhanh chóng (phản ứng siêu nhạy HR). Cần chú ý trong quá trình cảm ứng phản ứng siêu nhạy này có vai trò của NO. Người ta đã chứng minh rằng sự cân bàng NO/ H2O2 là cần thiết để cảm ứng phản ứng siêu nhạy.

7        H2O2 và NO tham gia dẫn truyền tín hiệu cho các đường hướng dẫn truyền tín hiệu hoặc phòng thủ khác. Ví dụ H2O2 có thể cảm ứng đường hướng MAPK hoặc cảm ứng để tổng hợp phenylalanin ammonia lyase (PLA), một enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp SA.

Câu 21: Đặc điểm và ví dụ (flagellin) về đường hướng dẫn truyền tín hiệu MAPK trong tương tác ký sinh - ký chủ?

·    Đường hướng MAPK là đường hướng dẫn truyền chủ chốt đối với tính kháng bệnh. Đây là một đường hướng chung đối với sinh vật nhân thật và là một cách dẫn truyền các tín hiệu ngoại bào thông qua các receptor bề mặt. Đường hướng MAPK dựa vào sự nhận biết thông qua PAMP/MAMP.

·    Sự nhận biết giữa receoptor của ký chủ và PAMP/MAMP của vi sinh vật (Vd: flg22, HrpZ, EF-Tu của vi khuẩn, Pep 13, NPP1, glucan của nấm trứng, chitin và ergosterol của nấm thật) dẫn tới một dòng thác dẫn truyền tín hiệu trong tế bào gọi là đường hướng dẫn truyền MAPK (Mitogen Activated Protein Kinases). MAPK là một protein kinase đặc hiệu serin/threonin có nghĩa nó sẽ phosphorin hóa nhóm OH của serin hoặc threonin. Một dòng thác MAPK nhìn chung là chuỗi MAPKKK=>MAPKK=>MAPK cho phép truyền các dấu hiệu ngoại bào thông qua receptor thành một loạt các phản ứng nội bào. Ví dụ bộ gen của Arabidopsis mã hóa ít nhất 20 MAPKs. Sự hoạt hóa dòng thác MAPK sẽ kích hoạt yếu tố phiên mã WRKY trong nhân tế bào và dẫn tới kích hoạt quá trình phiên mã của nhiều gen phòng thủ (WRKY là một họ protein có khả năng liên kết với promoter của các gen kháng).

·    Ví dụ đường hướng MAPK.

Flagellin là một loại PAMP chung được nghiên cứu nhiều nhất trong số các PAM/MAMP của vi khuẩn hại thực vật. Flagellin là protein cấu trúc của lông roi vi khuẩn. Flagellin chứa một đoạn 22 amino acid bảo thủ gọi là fgl22. Fgl22 có thể được nhận biết bởi một receptor của tế bào thực vật là FLS2. FLS2 là một receptor kinase xuyên màng với đoạn lặp giàu leucin (LRR) nằm phía ngoài màng tế bào (chịu trách nhiệm nhận biết) và một vùng có hoạt tính kinase nằm trong tế bào chất.

Ngay sau khi FLS2 nhận biết sự có mặt của fgl22, vùng kinase của nó sẽ khởi động đường hướng MAPK bằng cách hoạt hóa các kinase của tế bào là AtMEKK1=> AtMKK4/5=>AtMPK3/6, dẫn tới khởi động các yếu tố phiên mã hoạt động trong trong nhân (Vd: như yếu tố WRKY) và cuối cùng tổng hợp các hợp chất tạo ra tính kháng (vd như các PR protein).

Câu 22: Định nghĩa và đặc điểm của tính kháng tập nhiễm hệ thống (SAR). Đặc điểm của các chất kích kháng. Mô tả đặc điểm và vai trò của SA và BTH trong cảm ứng SAR?

Định nghĩa: Cây trồng trong quá trình tiến hóa đã phát triển một số cơ chế phòng thủ chống lại tác nhân gây bệnh. Trong những năm 1960, Ross đã quan sát thấy rằng khi lây nhiễm nhân tạo cây thuốc lá với virus TMV sẽ hình thành tính kháng hệ thống vì khi lây nhiễm tiếp TMV lần thứ 2 tại vị trí cách xa điểm lây nhiễm lần đầu thì vết chết hoại hình thành nhỏ hơn. Tính kháng kiểu này đã được gọi là tính kháng tập nhiễm hệ thống (SAR). Định nghĩa. SAR là loại tính kháng tạo được có tính lưu dẫn (hệ thống), phổ rộng (chống lại nhiều tác nhân gây bệnh), thường dẫn tới biểu hiện PR protein và thông qua hệ đường hướng dẫn truyền tín hiệu SA, JA/ET.

Đặc điểm của tính kháng tập nhiễm hệ thống (SAR):

SAR có thể được hình thành trên nhiều loài cây bởi các tác nhân gây vết bệnh chết hoại (là biểu hiện của phản ứng siêu nhạy hoặc là biểu hiện của triệu chứng).

Cần chú ý nếu tính kháng tạo được nhưng không lưu dẫn tức tính kháng chỉ hình thành xung quanh vị trí xâm nhiễm thì được gọi là tính kháng tập nhiễm cục bộ (local acquired resistance).

Dấu hiệu phân tử tín hiệu đặc trưng của SAR là SA có thể được tạo ra rất nhanh trong vòng vài giờ (4-6 giờ) sau lây nhiễm và nhân lên nhanh chóng; sau  khoảng 24 giờ SAR đã biểu hiện toàn cây. Sự di chuyển của SAR thường theo hướng từ dưới gốc lên trên ngọn.

3        Cây có thể duy trì SAR trong thời gian rất lâu, trong nhiều trường hợp kéo dài cả đời của cây.

Đặc điểm của các chất kích kháng:

SAR hình thành khi có sự tấn công của tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên nhiều thí nghiệm đã chứng tỏ rằng SAR có thể được tạo ra khi xử lý các hợp chất tự nhiên hoặc tổng hợp. Tất cả các hóa chất có khả năng cảm ứng SAR được gọi là các chất kích hoạt SAR (chất kích kháng).

Để có thể được xem là chất kích hoạt SAR thực sự, một hóa chất hoặc sản phẩm chuyển hóa của nó phải không có hoạt tính kháng sinh. Một số thuốc hóa học trừ bệnh ngoài hoạt tính kháng nấm còn có khả năng cảm ứng SAR như Fosetyl-Al (Aliet), metalaxyl, Cu(OH)2. Một số hóa chất cảm ứng SAR phổ biến bao gồm: SA, INA, BTH, Chitosan.

4        Đặc điểm và vai trò của SA và BTH trong cảm ứng SAR:

o SA (salicylic acid). Xem câu 19 đường hướng dẫn truyền SA

o INA (dichloroisonicotinic acid). INA có cơ chế cảm ứng SAR giống như  SA chống lại nhiều tác nhân gây bệnh. INA có thể cảm ứng SAR trước hoặc sau khi lây nhiễm. Điểm khác biệt so với SA là INA cảm ứng SAR độc lập với SA và hoạt động ở phía hạ lưu đường hướng dẫn truyền tín hiệu so với SA.

o BTH (benzo(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothiolic acid (BTH, acibenzolar-S-methyl). BTH là sản phẩm của hãng Novartis (bán tại Việt Nam với tên thương mại là BION). BTH có thể cảm ứng SAR ở liều lượng thấp, do vậy tránh được hiệu ứng gây độc cho cây. BTH có cơ chế tạo SAR giống như SA và có thể chống được nhiều nhóm tác nhân gây hại kể cả virus. BTH có hiệu quả chống nấm Cercospora nicotianae, Peronospora tabacina, Phytophthora parasitica, nhiều nấm phấn trắng, gỉ sắt và sương mai khác, vi khuẩn Pseudomonas syringae, virus TMV, CMV và TSWV.

Chitosan. Các oligomer của chitosan hình thành từ sự loại bỏ nhóm acetyl của chitin (dạng polymer mach thẳng của N-acetyl-D-glucosamine). Chitosan có khả năng kháng nấm trực tiếp (biến đổi cấu trúc vách tế bào nấm, ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chitin của vách tế bào nấm). Ngoài ra, chitosan cũng được biết là cảm ứng hình thành SAR .

Câu 23: Đặc điểm xâm nhiễm gây bệnh của nấm đạo ôn (Pyricularia oryzae). Đặc điểm của Pita gen. Trình bày mức độ đa dạng của quần thể nấm đạo ôn ở miền Bắc?

Đặc điểm xâm nhiễm gây bệnh của nấm đạo ôn (Pyricularia oryzae):

Nấm gây bệnh có tên giai đoạn vô tính là Pyricularia oryzae (syn. Piricularia oryzae). Giai đoạn hữu tính của nấm đã được đặt tên là Magnaporthe grisea và gần đây (2004), dựa vào các nghiên cứu phân tử, được đặt tên lại là M. oryzae.

Nấm thuộc lớp nấm túi (Ascomycetes), tuy nhiên ngoài tự nhiên nấm chỉ sinh sản vô tính tạo cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh không màu, 2 vách ngăn, hình quả lê (hoặc nụ sen).

Xâm nhiễm gây bệnh.

Nấm đạo ôn là nấm bán sinh dưỡng (hemibiotroph) với pha sinh dưỡng biotroph ở giai đoạn sớm của quá trình xâm nhiễm.

8        Giai đoạn sớm của quá trình xâm nhiễm bao gồm pha tiền xâm nhập (prepeneration): bào tử nấm tiếp xúc trên bề mặt lá, đỉnh bào tử nứt vỡ và tiết ra một giọt chất nhầy gắn kết chặt bào tử và bề mặt lá. Lớp chất nhày này chứa các hợp chất cacrbonhydrate và glycoprotein.

            Tiếp theo, bào tử nấm nảy mầm tạo ống mầm, hình thành một tế bào ở đỉnh ống mầm và phát triển thành vòi áp (appressorium). Vòi áp của nấm là một cấu trúc dạng vòm, có vách dày, mầu đậm do bị melanin hóa. Sự melanin hóa làm vách vòi áp trở nên chắc chắn hơn. Bên trong vòi áp, nấm tích lũy nhiều glycerol và do vậy áp lực trương của vòi áp nấm đạo ôn rất lớn, có thể tới 80 at.

Tiếp theo quá trình tiền xâm nhập là xâm nhập của bào tử: Từ vòi áp sẽ hình thành một sợi nấm nhỏ gọi là đế xâm nhập (infection peg) để xâm nhập trực tiếp qua tầng cutin và vào bên trong tế bào biểu bì. Bên trong tế bào biểu bì, đỉnh đế xâm nhập sẽ phình to tạo thành vòi hút (haustorium). Nấm sẽ tiết các enzyme và effector qua màng vòi hút vào tế bào chất của tế bào ký chủ và hấp thụ dinh dưỡng. Trong quá trình dinh dưỡng, vách tế bào ký chủ dần dần sụp đổ và nấm tiếp tục phát triển sang tế bào bên cạnh (thông qua sợi liên bào) và lại tiếp tục hình thành vòi hút ở tế bào mới bị xâm nhập.

            Nhiều yếu tố dẫn truyền tín hiệu tham gia vào quá trình nhận biết và hình thành vòi áp của nấm P. oryzae. Sự hình thành vòi áp chỉ xuất hiện trên bề mặt cứng (như bề mặt lá). Hai yếu tố chính tham gia vào quá trình dẫn truyền tín hiệu để hình thành vòi áp là chất lượng và bản chất hóa học của sự gắn kết.

2        Bề mặt bào tử nấm có chứa một lớp protein gọi là hydrophobin (Mpg1 protein) với phía ưa nước hướng vào tế bào nấm và phía ghét nước hướng về bề mặt của lá. Lớp hydrophobin giúp bào tử nhận biết được bề mặt ghét nước của lá và có vai trò quan trọng trong hình thành vòi áp.

            Một số gen của nấm (vd MagA, MagB) cảm ứng hình thành cAMP (cyclic adenosine monophosphate), một phân tử dẫn truyền tín hiệu kích thích hình thành vòi áp.

            Đặc điểm của Pita gen:

            Hiện có khoảng 40 gen kháng chủ đối với nấm P.oryzae đã được xác định trên lúa với khoảng gần 10 gen đã được clone. Trong số các gen này, Pi-ta là gen kháng được nghiên cứu nhiều nhất.

Pi-ta là gen nằm ở vùng trung tâm của nhiễm sắc thể số 12. Protein Pi-ta là một protein (928 aa) kháng R thuộc lớp CNL (CC-NB-LRR) hoạt động tại tế bào chất. Vùng lặp giàu leucine (LRR) của Protein Pi-ta tương tác trực tiếp với AvrPi-ta để tạo tính kháng. Các allen pi-ta (lặn) ở các giống nhiễm bệnh mã hóa cho một protein chỉ khác 1 aa so với allen Pi-ta (trội). Các gen kháng như Pi-ta2 là gen allen của Pi-ta.

9        Nấm M. oryzae tạo ra 3 nhóm Avr protein có thể được nhận biết ở mức đặc hiệu giống, trong đó quan trọng nhất là AvrPita protein. AvrPita gen nằm ở gần đầu nhiễm sắc thể của nấm và mất đỉnh nhiễm sắc thể nấm (chứa AvrPita gen) là một cơ chế dẫn tới nấm có khả năng gây bệnh. AvrPita có bản chất protease và tương tác với protein kháng tương ứng của ký chủ là Pita protein. Tương tác giữa AvrPita và Pita là tương tác trực tiếp.

Vách tế bào

Màng tế bào                

            Mức độ đa dạng của quần thể nấm đạo ôn ở miền Bắc:

o  Đa dạng của nấm/ Bộ giống chỉ thị

§ Nấm Pyricularia oryzae được xem là một quần thể không đồng nhất. Dựa trên các phân tích phân tử, nhìn chung nấm được phân nhóm trên cở sở phân bố địa lý (vd: nhóm châu Mỹ, châu Âu, Nhật bản, Iran...). Nhìn chung, các quần thể nấm thuộc các khu vực khởi nguyên cây lúa (chẳng hạn ở khu vực dãy Hymalaya, hoặc Đông Nam Á) có mức độ đa dạng cao hơn.

§ Thông tin về mức độ đa dạng di truyền của bất kỳ quần thể tác nhân gây bệnh nào đều cần thiết cho các chương trình chọn tạo giống kháng bệnh. Đối với nấm đạo ôn, vào năm 1967, IRRI đã thiết lập một hệ thống phân biệt các chủng sinh lý race/pathotype của nấm dựa trên một bộ giống chỉ thị gồm 8 giống, theo thứ tự là: Raminad, Zenith, NP-125, Usen, Dular, Kanto 51, Sha-tiao-tsao, Caloro. Hệ thống phân biệt các race nấm này vẫn được sử dụng tại nhiều nước trên thế giới.

§ Các race nấm, được thử tính gây bệnh trên bộ giống này, sẽ được ký hiệu như sau: I (từ international); tiếp theo là 1 trong các chữ A, B, C, D, E, F, G, H, (mỗi chữ đại diện cho một giống chỉ thị và tương ứng với giống mẫn cảm đầu tiên khi thử trên tám giống theo thứ tự ở trên); cuối cùng là một số chỉ kiểu tính độc. Ví dụ một isolate nấm có phản ứng S, R, R, R, R, R, R, R (S = susceptible, R = resistant) có ký hiệu là IA. Dựa vào hệ thống này, tối đa 256 nhóm chủng (28) có thể được phân biệt, trong đó lần lượt 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2 và 1 nhóm chủng ở các nhóm chủng IA, IB, IC, ID, IE, IF, IG và IH.

§ Tuy nhiên vì bộ giống chỉ thị này chỉ chứa ít gen kháng (khoảng 5 gen) nên không thể đánh giá được mức độ đa dạng của nấm. Hiện nay, ngoài bộ giống chỉ thị trên, các nước đều phát triển bộ giống chỉ thị riêng, đặc biệt sử dụng các dòng gần đẳng gen (near isogenic lines) chứa 1 hoặc vài gen kháng.

o  Quần thể nấm P. oryzae tại miền Bắc Việt Nam

§ Sử dụng kỹ thuật AFLP, Nguyễn Thị Ninh Thuận (2006) đã nghiên cứu mức độ đa dạng và tính gây bệnh của 114 isolates nấm thu thập tại nhiều tỉnh thuộc đồng bằng sông Hồng. Nghiên cứu này cho thấy:

§ Quần thể nấm P. oryzae tại đồng bằng sông Hồng có tính đa dạng cao gồm 7 nhóm VNG1, VNG2,..., VNG7.

§ Quần thể nấm phân lập trên các giống lúa tẻ khác quần thể nấm phân lập trên các giống lúa nếp. Quần thể nấm trên lúa tẻ gồm 4 nhóm VNG1, VNG2, VNG3 và VNG4, còn trên lúa nếp gồm 3 nhóm VNG 5, VNG6 và VNG7.

§ Các nhóm VNG1, VNG3, VNG 4 chiếm ưu thế với VNG1 chiếm tới hơn 50%.

§ Nhiều giống chỉ thị mang nhiều gen kháng có thể chống được quần thể nấm P. oryzae của miền Bắc (ví dụ giống Morobenekan mang các gen kháng Pi-7(t), Pi-10(t), Pi-12(t), Pi-44(t), Pi-157), tuy nhiên không thể biết được gen nào điều khiển tính kháng.

§ Dựa trên phản ứng của đại diện các nhóm đối với các giống chỉ thị có số lượng gen kháng ít, các gen kháng sau nên được sử dụng để tạo giống kháng nấm đạo ôn ở miền Bắc: Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-ta2, Pi-k.

o Các giống kháng nhiễm

§ Việt Nam thuộc khu vực khởi nguyên của cây lúa với tập đoàn giống phong phú. Nhiều giống cổ truyền của Việt Nam mang các gen kháng bệnh đạo ôn quí. Hiện nay, Việt Nam có ít nhất 1 giống lúa cổ truyền là Tetep đang được nhiều nước sử dụng (thông qua IRRI) làm vật liệu nghiên cứu tính kháng. Tetep là một giống có tính kháng cao đối với rất nhiều chủng đạo ôn; một số gen kháng đã được xác định trên giống này như Pi-3(t), Pi-ta, Pi-ta2, Pi-tp(t).

§ Ở Việt Nam, một số giống lúa kháng đạo ôn đã được tạo ra như C70, C71, IR1820, X20, X21.

§ Hiện nay, một số giống lúa trồng phổ biến ở miền Bắc có chất lượng và năng suất tốt như Khang Dân 18, Bắc Thơm số 7, Hương Thơm số 1, Nếp IR352... đều nhiễm nấm đạo ôn.

Câu 24 : Đặc điểm xâm nhiễm của vi khuẩn bạc lá lúa (Xanthomonas oryzae pv. oryzae). Mô tả đặc điểm và tương tác của Xa21, xa5 và Xa27?

Bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra. Vi khuẩn lúc đầu được đặt tên là Bacillus oryzae, đổi tên thành X. oryzae (năm 1922). Năm 1978, vi khuẩn được đặt lại tên là Xanthomonas campestris pv. oryzae và vào năm 1990, vi khuẩn được phân loại lại với tên hiện đang được sở dụng là Xoo.

Xo là vi khuẩn gram (-) hình gậy, 2 đầu tròn, kích thước (0.7-2) x (0.4-0.7), vi khuẩn di động với một lông roi. Khuẩn lạc trên môi trường nhân tạo tròn, lồi, nhầy, màu vàng (do hình thành sắc tố xanthomonadin). Xoo tạo nhiều polysacharide ngoại bào EPS (= extracellualar polysacharide), có vai trò quan trọng trong việc hình thành giọt dịch vi khuẩn trên lá bệnh, bảo vệ vi khuẩn khỏi bị khô và tạo điều kiện cho vi khuẩn phát tán nhờ gió, mưa. Vi khuẩn hảo khí bắt buộc, không hình thành bào tử, nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 25-30OC.

Đặc điểm xâm nhiễm của vi khuẩn bạc lá lúa (Xanthomonas oryzae pv. Oryzae) :

o Xoo xâm nhập vào lá qua thủy khổng ở mép lá và chót lá là chủ yếu. Vi khuẩn trên bề mặt lá có thể di chuyển trên màng nước (nhiều vào ban đêm) để xâm nhập vào thủy khổng. Sau khi xâm nhập vào bên trong, vi khuẩn nhân lên trong gian bào và tiếp theo, xâm nhập và lan truyền trong lá theo mạch xylem. Vi khuẩn cũng có thể xâm nhập vào xylem qua tổn thương cơ giới hoặc lỗ mở khi rễ mới hình thành ở gốc bẹ lá.

o Bên trong xylem, vi khuẩn di chuyển theo chiều dọc theo gân chính của lá nhưng cũng có thể từ xylem, di chuyển sang 2 bên. Trong vòng vài ngày, tế bào vi khuẩn và EPS lấp đầy mạch xylem và tiết dịch vi khuẩn qua thủy khổng thành giọt dịch hoặc sợi dịch vi khuẩn (dấu hiệu đặc trưng của bệnh và là nguồn bệnh thứ cấp quan trọng).

o (Phân biệt với đốm sọc vi khuẩn (Xoc) : Xoc xâm nhập chủ yếu qua khí khổng, nhân lên trong xoang khí khổng, sau đó phát triển trong gian bào của nhu mô).

Đặc điểm và tương tác của Xa21, xa5, Xa27 :

Các gen kháng lúa đã được bắt đầu nghiên cứu tại Nhật và IRRI khảng 30 năm trước đây. Tạo giống kháng mang gen kháng chủ là cách phòng chống hiệu quả nhất đối với bệnh bạc lá. Cho tới nay (tính tới 2007), khoảng 29 gen kháng Xoo (ký hiệu từ Xa1 tới Xa29) đã được khám phá trên lúa, trong số đó, 19 là gen kháng trội. Sáu gen (Xa1, Xa5, Xa21, Xa26 và Xa27) đã được phân lập và giải trình tự. Trong số 6 gen này, 2 gen Xa21 và Xa26 có đặc điểm giống như các receptor. Một số gen Xa quan trọng là :

Xa21. Đây là gen đầu tiên trong số các gen kháng được phân lập trên lúa. Xa21 được phân lập đầu tiên từ cây lúa dại Oryzae longistaminata, tiếp theo được chuyển vào giống IR24 để tạo ra dòng gần đẳng gen IRBB21. Xa21 là một protein xuyên màng giống như receptor bề mặt có cấu tạo gồm một  đầu LRR bên ngoài màng có chức năng nhận biết, một phần xuyên màng và một đầu có hoạt tính kinase có chức năng truyền tín hiệu. Xa21 là một gen kháng chủ, trội, phổ rộng chống nhiều chủng Xoo (ít nhất đã được chứng minh trên nhiều chủng của Ấn Độ, Philippin). Ngoài ra Xa21 có khả năng kháng cao và đặc hiệu đối với các chủng Xoo thuộc race 1 của Nhật Bản và được sử dụng rộng rãi trong các chương trình tạo giống kháng bạc lá ở Nhật. Xa21 sẽ được biểu hiện khi lây nhiễm nhân tạo Xoo hoặc khi gây tổn thương cơ giới trên cây. Xa21 là một gen R qui định tính kháng vào giai đoạn trưởng thành của cây lúa.

xa5. Đây  gen kháng lặn, qui định tính kháng phổ rộng (ít nhất đã được chứng minh trên nhiều race Xoo của Philippin và Việt Nam). xa5 mã hóa tiểu phần γ của yếu tố phiên mã TFIIA (yếu tố phiên mã hoàn chỉnh - ký hiệu là TFIIAγ). Tính kháng lặn của xa5 có thể được giải thích như sau : xa5 và Xa5 mã hóa các isoform của TFIIAγ (chỉ khác nhau ở aa số 39) và do đó có ái lực liên kết khác nhau với vùng hoạt hóa phiên mã (Activated Domain - AD) của AvrXa5 của vi khuẩn (AvrXa5 là một Avr thuộc họ AvrBs3 của vi khuẩn). AvrXa5 liên kết với isoform TFIIAγ Xa5 (gen trội trên giống nhiễm) dẫn tới hoạt hóa các gen của ký chủ có lợi cho sự gây bệnh. Trái lại AvrXa5 không liên kết với isoform TFIIAγ xa5 (gen lặn trên giống kháng) dẫn tới các gen của ký chủ có lợi cho sự gây bệnh không được biểu hiện, hậu quả là cây kháng bệnh.

4        Xa1. Đây là gen kháng trội thuộc nhóm NBS-LRR. Xa1 có đặc điểm cấu trúc và chức năng tương tự gen RPS2 trên cây Arabidopsis, gen N trên cây thuốc lá và gen L6 trên cây lanh. Tổn thương cơ giới và sự nhiễm bệnh do Xoo cảm ứng biểu hiện gen Xa1. Xa1 qui định tính kháng cao nhưng phổ hẹp, chống được các chủng thuộc race 1 của Nhật.

            Xa27. Đây là gen kháng phổ rộng chống được nhiều chủng Xoo. Tính kháng của Xa27 di truyền theo kiểu bán trội. Các allen của locus Xa27 mã hóa cho các protein đồng nhất (có nghĩa protein Xa27 giống hệt protein xa27). Điều này cho thấy sự khác nhau về tính kháng ở cây Xa27 và tính mẫn cảm ở cây xa27 là do sự khác nhau về trình tự nts trên vùng promotor của gen Xa27/xa27. Người ta đã chứng minh bằng thực nghiệm là chỉ gen Xa27 được biểu hiện khi nhiễm với Xoo mang gen AvrXa27 (là một Avr thuộc họ AvrBs3 của vi khuẩn). AvrXa27 tương tác vớí vùng promotor của gen Xa27, kích hoạt sự biểu hiện của gen này và dẫn tới tính kháng.

Câu 25: Mức độ đa dạng của quần thể vi khuẩn Xoo tại châu Á và Việt Nam. Đặc điểm và vai trò của các giống dòng chỉ thị đẳng gen đối với Xoo?

Vi khuẩn Xoo có tính đa dạng cao. Tới nay (2007), khoảng 30 race vi khuẩn đã được công bố từ nhiều nước trên thế giới dựa vào đặc tính gây bệnh trên các bộ giống chỉ thị hoặc dựa vào các nghiên cứu phân tử. Tuy nhiên, vì được đánh giá độc lập nên các race từ các nước không giống nhau (mặc dù có thể chung ký hiệu). Ví dụ các isolates Philippin được chia thành 10 race (ký hiệu là race 1, 2....10) còn các isolates của Trung Quốc được chia thành 9 races (cũng ký hiệu là race 1, 3, 3....9) và các race của Trung Quốc không tương ứng với các race của Philippin. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, mặc dù có sự di chuyển của vi khuẩn từ vùng này sang vùng khác nhưng nhìn chung có sự khác nhau giữa quần thể Xoo của các nước. Điều này dẫn tới việc nghiên cứu mức độ đa dạng của mỗi nước/vùng sinh thái là cần thiết trước khi thực hiện các chương trình chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá.

Đa dạng của Xoo tại Việt Nam:

Nghiên cứu hợp tác giữa trường ĐHNNI và ĐH Kyushu Nhật Bản trong giai đoạn 2001-2005 dựa trên phản ứng kháng nhiễm đối với 11 dòng đẳng gen mang gen kháng đơn (dòng số 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 12, 13, bảng trên) cho thấy quần thể Xoo ở các tỉnh phía bắc Việt Nam khá đa dạng gồm 12 race (chú ý, một số nước dùng bộ dòng đẳng gen tương tự cũng phát hiện thấy mức đa dạng khá lớn; chẳng hạn ở Nepal là 26 races; Srilanka là 14).

Các race chiếm ưu thế tại miền Bắc Việt Nam, theo thứ tự, là các race 5 (gen kháng: xa5, Xa7 và Xa21), race 3 (gen kháng: Xa4, xa5, Xa7 và Xa21) và race 2 (gen kháng: Xa4, xa5, Xa7, Xa14 và Xa21).

Đặc điểm và vai trò của các giống dòng chỉ thị đẳng gen đối với Xoo:

Các bộ giống chỉ thị hiện nay đang sử dụng phổ biến gồm các giống/dòng gần đẳng gen (near isogenic lines) chứa một gen kháng (single gene) hoặc vài gen (pyramid line). Tuy nhiên vì các dòng đa gen (pyramid) thường biểu hiện tính kháng với hầu hết các chủng nên ít có giá trị trong phân biệt các chủng.

Các giống/dòng chỉ thị đẳng gen chỉ chứa một gen kháng duy nhất đối với các chủng của Xoo. việc sử dụng các giống/dòng chỉ thị đẳng gen thường có ý nghĩa lớn trong việc phân biệt các chủng khác nhau à giúp xác định được mức độ đa dạng của từng vùng sinh thái à tạo điều kiện thuận lợi trong các chương trình chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá.

Câu 26 : Đặc điểm sự tái sinh và tính kháng đối với begomovirus?

Tái sinh (sinh sản) của begomovirus

            Begomovirus, giống như các geminivirus khác, tái sinh theo cơ chế vòng lăn (rolling circular mechanism). Cơ chế vòng lăn có thể được chia làm 2 pha và được thực hiện trong nhân tế bào ký chủ.

            Pha tổng hợp sợi DNA vòng đơn (bộ gien có mặt trong phân tử virus) thành sợi DNA vòng kép khi bộ gien virus được chuyển vào nhân tế bào. Như vậy sợi kép sẽ gồm một sợi virus và một sợi tương đồng virus. Pha này vẫn chưa được hiểu rõ.

            Pha tái sinh theo cơ chế vòng lăn: Protein Rep (sau khi được tổng hợp) sẽ cắt sợi virus tại chuỗi bảo toàn TATATTAC. Nhờ vật liệu cũng như enzyme DNA polymearase của tế bào, sợi virus được tổng hợp liên tục trên sợi tương đồng virus. Protein Rep lại tiếp tục cắt sợi virus mới được tổng hợp tại chuỗi TATATTAC (cũng vừa mới được tổng hơp) thành một sợi virus hoàn chỉnh dưới dạng sợi đơn mạch thẳng. Protein Rep sau đó sẽ nối 2 đầu của mạch thẳng để tạo ra bộ gien virus sợi đơn mạch vòng hoàn chỉnh.

Tính kháng đối với begomovirus

            Tính kháng của begomovirus thông qua gen kháng

Cho tới nay, người ta chưa phát hiện thấy gen kháng R chống lại begomovirus trên cây cà chua trồng (Lycopersicon esculentum). Tuy nhiên một số gen kháng chống lại begomovirus đã được phát hiện thấy trên một số giống cà chua dại. Ví dụ Ty1 gen được phân lập từ cây cà chua dại (Lycopersicon chilense) và là một gen kháng trội không hoàn toàn. Ty-1 dường như tương tác với các protein chịu trách nhiệm di chuyển của virus để tạo tính kháng. Ty-1 đã được chuyển vào cà chua trồng để tạo giống kháng.

            RNA silencing và begomovirus

RNA silencing là cơ chế quan trọng của cây (cũng như của nấm, động vật) nhằm điều hòa biểu hiện gen và chống sự xâm nhiễm virus. Cây có một số đường hướng silencing, trong đó quan trọng nhất là đường hướng RNA silencing thông qua siRNA. Đây là đường hướng xảy ra ở tế bào chất và trong trường hợp chống sự xâm nhiễm virus sẽ gồm các bước chính sau:

Hình thành các dsRNA trong tế bào chất. Các virus RNA thực vật trong quá trình tái sinh sẽ hình thành các sản phẩm trung gian là dsRNA. Các begomovirus, do các gen mã hóa theo 2 chiều ngược nhau dẫn sản phẩm phiên mã của chúng (các transcripts) sẽ gối lên nhau và tương đồng ở đầu 3'. Phần tương đồng gối lên nhau này sẽ bắt cặp để tạo đoạn dsRNA.

3        Các protein Dicer (là một endonuclease thuộc RNAse nhóm 3, chịu trách nhiệm cắt các phân tử RNA sợi kép) của tế bào ký chủ sẽ cắt đoạn dsRNA thành các phân tử dsRNA nhỏ có kích thước 21-22 nts gọi là các siRNA.

Các phân tử siRNA sợi kép tách thành các phân tử siRNA sợi đơn và kết hợp với các phân tử protein của tế bào tạo thành phức hợp RISC (RNA Induced Silencing Complex), trong đó chứa một RNA endonuclease là Argonaute (ký hiệu là AGO).

RISC sẽ nhận biết được các phân tử RNA virus trong tế bào chất và tương đồng với siRNA. Đoạn siRNA sợi đơn sẽ bắt cặp đặc hiệu với phần tương đồng trên phân tử RNA virus và AGO của RISC sẽ cắt phân tử RNA virus. 

RNA silencing là một cơ chế của cây chống lại virus thì virus cũng có cơ chế để chống lại sự silencing của cây. Người ta đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng C4 (hay AC4) của begomovirrus có thể ức chế đường hướng RNA silencing của cây ký chủ trong tế bào chất.

Câu 27 : Vai trò của tính kháng ngang và tính kháng dọc trong chọn tạo giống kháng bệnh?

· Tính kháng dọc

Tính kháng dọc thường do một hoặc một vài gen qui định nên còn được gọi là tính kháng đơn gen. Các gen này điều khiển các bước/sự kiện quan trọng trong quá trình phát triển bệnh do đó còn được gọi là các gen kháng chủ. Chỉ cần một hoặc một vài gen kháng chủ đã có thể tạo ra tính kháng. Tính kháng dọc mang tính đặc hiệu cao, nhằm vào một hoặc một số chủng tác nhân gây bệnh chỉ có thể chống được các chủng tương thích của tác nhân gây bệnh (nên còn được gọi là tính kháng đặc hiệu chủng). Di truyền tính kháng dọc tuân theo qui luật di truyền Mendel và quan hệ giữa gen ký chủ qui định tính kháng dọc và gen tương ứng của ký sinh là quan hệ gen-for-gen.

Cây mang tính kháng dọc nhìn chung kháng hoàn toàn tác nhân gây bệnh. Hơn nữa tính kháng dọc dễ thao tác hơn (phân lập, chuyển gen, đánh giá) trong các chương trình nhân giống nên thường được ưa thích hơn.

Tính kháng dọc, mặc dù rất hiệu quả chống lại các chủng tương ứng của tác nhân gây bệnh nhưng nhìn chung không bền vững. Tính kháng có thể bị mất nếu xuất hiện trong quần thể tác nhân gây bệnh các chủng mới không tương thích (từ nơi khác tới hoặc chủng bị kháng đột biến) có khả năng gây bệnh (xem thêm phần đồng tiến hóa R-Avr chương 4).

Tính kháng dọc, do vậy, có hiệu quả nhất khi:

4        Được tổng hợp vào cây hàng năm dễ nhân giống như cây cốc hạt nhỏ (lúa mỳ, lúa...).

5        Nhằm chống các loại tác nhân gây bệnh không sinh sản hoặc phát tán nhanh như nấm Fusarium, hoặc không đột biến nhanh như nấm Puccinia

6        Bao gồm các gen kháng chủ đủ "mạnh" để bảo vệ hoàn toàn và lâu dài cây ký chủ.

7        Quần thể ký chủ không chỉ gồm 1 giống đồng nhất về di truyền được trồng trên một vùng rộng lớn.

Nếu một hoặc nhiều điều kiện trên không đáp ứng được thì tính kháng dọc sẽ nhanh chóng bị phá vỡ. Ngoài ra, tính kháng dọc, vì mức độ kháng rất cao nên cũng tạo áp lực chọn lọc lớn lên quần thể tác nhân gây bệnh dẫn tới dễ hình thành các chủng tác nhân gây bệnh mới.

Vì tính kháng dọc dễ bị bẻ gẫy bởi một chủng tác nhân gây bệnh độc mới hình thành nên nhiều chiến lược đã được áp dụng để khắc phục nhược điểm này chẳng hạn như hỗn hợp giống hoặc tạo giống mang nhiều gen kháng chủ.

Hỗn hợp giống (cultivar mixture). 

Trong trồng trọt, người ta có thể làm giảm sự phát triển của dịch bệnh bằng cách tạo ra sự đa dạng di truyền của một loài cây trồng. Phương pháp đơn giản nhất để tạo ra sự đa dạng này là hỗn hợp giống (cultivar mixture). Hỗn hợp giống là hỗn hợp các giống giống nhau về các đặc trưng nông học như thời gian sinh trưởng, phát triển, chất lượng và hình dạng hạt...nhưng khác nhau về gen kháng.

Hỗn hợp giống không chống hoàn toàn được bệnh nhưng làm giảm đáng kể tốc độ phát triển bệnh nhờ 4 cơ chế:

(i) Khoảng cách giữa các cây mẫn cảm tăng dẫn tới giảm tốc độ phát tán.

(ii) Tương tự, tạo ra rào cản vật lý là các cây của giống có tính kháng cao.

(iii) Tạo tính kháng tạo được do chủng không độc gây ra.

(iv) Thay đổi vi khí hậu theo hướng bất lợi cho bệnh. Vd. trong một thí nghiệm hỗn hợp giống giữa 1 lúa nếp (mẫn cảm với nấm đạo ôn, có chiều cao cao hơn 35-40 cm ) 1 giống lúa tẻ, số ngày với ẩm độ 100% vào 8 giờ sáng trên ruộng thí nghiệm đã giảm từ 20 ngày xuống còn khoảng 2 ngày và diện tích lá lúa nếp bị phủ sương đã giảm từ 84% xuống 36% (Zhu et al. 2005). Kết quả TLB trên giống lúa nếp đã giảm 90%.

Hỗn hợp giống đặc biệt có ý nghĩa đối với các bệnh hại phần trên mặt đất đa chu kỳ. Ví dụ: tại TQ, đến năm 2000, >3000 ha lúa tại tỉnh Vân Nam áp dụng phương pháp hỗn hợp giống để chống bệnh đạo ôn, TLB giảm 1 - 20 % .

5        Tổng hợp nhiều gen kháng trong một giống. Người ta có thể lai các giống mang các gen kháng khác nhau để tạo ra giống chứa nhiều gen kháng. Thông thường tính kháng của các giống mang nhiều gen kháng chủ thường khá bền vững vì tác nhân gây bệnh không dễ đột biến đồng thời để bẻ gẫy nhiều gen kháng. Tuy nhiên, việc tạo giống mang nhiều gen kháng rất phức tạp.

·  Tính kháng ngang

Tính kháng ngang thường do nhiều gen qui định (nên còn được gọi là tính kháng đa gen), mỗi gen đóng góp một mức độ nhỏ vào tính kháng (nên còn được gọi là tính kháng gen thứ). Tính kháng ngang di truyền theo qui luật di truyền số lượng (nên còn được gọi là tính kháng số lượng).

Tính kháng ngang qui đinh tính kháng không hoàn toàn nhưng bền vững. Tính kháng ngang không bị bẻ gẫy nhanh và bất thình lình như tính kháng dọc. Tính kháng ngang liên quan đến nhiều quá trình dẫn tới phản ứng phòng thủ. Tính kháng ngang có mặt khắp nơi, trên cả cây trồng lẫn cây dại, chống tất cả các chủng của tác nhân gây bệnh kể cả những chủng độc nhất (nên còn được gọi là tính kháng không đặc hiệu).

3        Tính kháng ngang (tính kháng cơ bản) nhìn chung có mức độ kháng thấp và do đó tạo áp lực chọn lọc thấp lên quần thể tác nhân gây bệnh.

·   Có thể tóm tắt tính kháng dọc và ngang ở bảng sau

Chỉ tiêu

Giống kháng dọc

Giống kháng ngang

1.Số lượng gen kháng

1 vài gen kháng (đơn gen)

Nhiều gen kháng(đa gen)

2.Tính (chọn lọc) chuyên tính của gen kháng

Rất chuyên tính

Không chuyên tính

3.Mức độ kháng

Cao

Thấp

4.Tính ổn định

Không bền vững )

Bền vững

5. Kháng đối với thành phần chủng trong quần thể ký sinh

ít chủng

Hầu hết các chủng trong quần thể ký sinh

6.Tác động của gen kháng vào quần thể ký sinh  (áp lực chọn lọc)

Thúc đẩy sự phát sinh hình thành các nòi, race mới (chủng có độc tính cao hơn)

Không thúc đẩy sự phát sinh hình thành các nòi race mới (quần thể ký sinh ổn định lâu dài)

8.Phản ứng tự vệ

Thường là phản ứng siêu nhạy

Các phản ứng khác nhau

9.Di truyền

Theo quy luạt di truyền Mendel, phần lớn di truyền tính trội

Theo di truyền số lượng

10. Ảnh hưởng của ngoại cảnh

Ít bị ảnh hưởng

Dễ bị ảnh hưởng

Câu 28 (hic câu cuối cùng đây chết mất, mệt quá cơ): Nguồn gen kháng bệnh? Ví dụ về nguồn gen kháng bệnh đạo ôn, bạc lá và begomovirus?

Nguồn gen kháng bệnh có chung "bể gen" như đối với các gen qui định các tính trạng di truyền khác. "Bể gen" này có thể là các giống địa phương hiện trồng, giống nhập nội, giống địa phương cổ truyền, giống đã bị loại bỏ, các loài cây họ hàng hoang dại và cả các giống được gây đột biến nhân tạo.

 Thông thường, gen kháng bệnh có thể tìm thấy trên các cây sống sót tại nơi có áp lực bệnh cao hoặc nơi có bệnh nặng. Trong trường hợp không thể tìm thấy cây sống sót tại một nơi có bệnh nặng thì gen kháng có thể tìm ở loài cây tương ứng trồng ở nơi khác hoặc tìm trên họ hàng hoang dại. Một khả năng nữa để tìm nguồn gen kháng là tìm trên cây tại trung tâm khởi nguyên của tác nhân gây bệnh vì nếu cây đã tồn tại lâu dài cùng với sự có mặt của bệnh thì chứng tỏ chúng phải mang gen kháng. Tương tự nguồn gen kháng cũng có thể tìm thấy tại trung tâm khởi nguyên của cây.

Thuyết Vavilop về đồng tiến hóa ký sinh - ký chủ

10    Vùng khởi nguyên xuất sứ của một loài cây trồng là trung tâm hình thành phong phú nhất các loại, dạng, giống của loài cây trồng đó và cây dại. Nhưng ở đó cũng là trung tâm hình thành đầy đủ nhất các loài, dạng, chủng, nòi của ký sinh nhờ có quá trình tiến hoá và chọn lọc tự nhiên giữa ký sinh và ký chủ đã diễn ra ở đây lâu đời nhất.

Tính đa dạng cây trồng và ký sinh ở vùng này thể hiện qua quá trình biến dị mạnh mẽ nhất, nhờ đó xuất hiện và tích luỹ nhiều giống có tính kháng cao và đồng thời xuất hiện và tích luỹ nhiều chủng ký sinh có tính độc cao.

Quan hệ ký sinh và ký chủ đó cũng luôn biến động song cũng đảm bảo thế cân bằng bền giữa ký sinh và ký chủ tạo thuận lợi cho sự phát triển của cả 2 phía. Phía cây trồng có các đặc tính chống bệnh mới, đồng thời tạo cho ký sinh có độc tính mới để vượt qua tính kháng của cây trồng đó.

Trong mối quan hệ đồng tiến hoá đó thì tiến hoá khởi đầu chỉ thấy ở các loài cây ký chủ sau đó mới xuất hiện chủng ký sinh có tính độc mới để cùng tồn tại. Vậy chúng ta cần tìm kiếm nguồn gen kháng ở loài cây, giống cây ở vùng địa lý, xuất sứ khởi nguyên của chúng trên thế giới. Nguồn gen kháng đó là nguồn vật liệu nguyên thuỷ có triển vọng nhất trong lai tạo chọn lọc giống có tính miễn dịch và kháng sâu bệnh.

Việc lựa chọn gen kháng hoặc yếu tố kháng căn cứ vào nhiều yếu tố, quan trọng nhất là mức độ đa dạng của quần thể tác nhân gây bệnh, đặc tính gây bệnh và tính độc của quần thể tác nhân gây bệnh đặc biệt là của các chủng, nòi chiếm ưu thế. Ngoài ra các gen được lựa chọn nên có khả năng kháng phổ rộng.

Ví dụ 1. Đối với bệnh đạo ôn ở miền Bắc Việt Nam, các gen kháng Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-ta2, Pi-k nên được sử dụng để tạo giống kháng nấm đạo ôn.

Ví dụ 2. Đối với bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam, vì các race 5, 3 và 2 chiếm ưu thế trong quần thể vi khuẩn bạc lá nên các gen kháng xa5, Xa7 và Xa21 nên được sử dụng.

6        Ví dụ 3. Đối với bệnh xoăn vàng lá cà chua do begomovirus, trong trường hợp sử dụng kỹ thuật kháng dựa vào RNA silencing, người ta nên chọn các vùng gen hoặc gen bảo thủ cho cả chi begomovirus, chẳng hạn như đầu C của gen CP hoặc đầu N của gen Rep để tạo các cấu trúc RNA silencing chuyển vào cây cà chua.

Câu 1: Định nghĩa và đối tượng miễn dịch thực vật. Kể 2 sự kiện liên quan đến lịch sử miễn dịch thực vật?

1        Miễn dịch: Immunity là một thuật ngữ y học mô tả trạng thái có đủ sự phòng thủ sinh học nhằm chống lại sự nhiễm bệnh hay sự tấn công của các tác nhân sinh học. Tương tự như vậy, đối với thực vật thì miễn dịch có thể hiểu là khả năng của cây duy trì sự không bị bệnh trước sự tấn công của các tác nhân sinh học.

2        Các tác nhân sinh học ở đây bao gồm: Các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn), virus, tuyến trùng, côn trùng (đặc biệt là nhóm côn trùng chích hút) và các tác nhân do môi trường bất lợi.

à Định nghĩa: Miễn dịch trong môn học miễn dịch thực vật cần được hiểu rộng là khả năng của cây chống lại ở mọi mức độ của sự tấn công của các tác nhân gây bệnh nhờ các đặc điểm cấu trúc và di truyền. Theo định nghĩa này, miễn dịch có thể hiểu là tính kháng của cây với các tác nhân gây bệnh.

1        Đối tượng của miễn dịch thực vật: nghiên cứu sự tương tác giữa tác nhân gây bệnh và cây ký chủ trong quá trình gây bệnh nhằm hiểu và ứng dụng khả năng kháng bệnh của cây.

2        Hai sự kiện liên quan đến lịch sử miễn dịch thực vật:

o Năm 1894, Ericksson đã phát hiện ra nấm gỉ sắt trên thân cây cốc (Puccinia graminis) gồm các chủng sinh lý không thể phân biệt nhau về mặt hình thái (giống nhau cả về hình thái nấm (bào tử) và triệu chứng - dấu hiệu bệnh) nhưng lại khác nhau về tính gây bệnh trên cây ký chủ, hiện nay đã phân lập được ra các chủng đó là:

§ Puccinia graminis f.sp. tritici gây hại lúa mỳ.

§ Puccinia graminis f.sp. avenae gây hại đại mạch.

§ Puccinia graminis f.sp. secalis gây hại tiểu mạch.

o Năm 1902 Ward, và năm 1915 Stakman, khi nghiên cứu bệnh gỉ sắt trên cây lúa mỳ đã ghi nhận phản ứng chết hoại rất nhanh trên mô lúa mỳ do nấm và gọi phản ứng này là phản ứng siêu nhạy (hypersensitive response).

o Năm 1905, Biffen cho biết tính kháng bệnh gỉ sắt của 2 giống lúa mỳ Michigan Bronze (S) và Rivet (R) di truyền theo quy luật của Mendel (F1: 100% S, F2 - 3 S/1 R).

o Năm 1909, Orton khi nghiên cứu bệnh héo Fusarium (Fusarium oxysporum) trên cây bông, dưa hấu và đậu đã phân biệt các khái niệm kháng bệnh (resistance), thoát bệnh (escape) và chịu bệnh (tolerance).

o Năm 1914, Stakman và đồng nghiệp đã giải thích:

§ Một giống cây kháng bệnh ở vùng này nhưng có thể nhiễm bệnh tại vùng khác.

§ Tính kháng bệnh thay đổi từ năm này sang năm khác.

§ Lý do các giống kháng trở nên nhiễm bệnh bất thình lình.

à Tất cả đều do sự có mặt hay sự thay đổi thành phần chủng sinh lý của các tác nhân gây bệnh.

o Năm 1964, Klement và đồng nghiệp ghi nhận phản ứng siêu nhạy cũng xảy ra ở cây bị vi khuẩn tấn công. Năm 1972, phản ứng siêu nhạy cũng được ghi nhận trên động vật và gọi là apoptosis.

o Năm 1940-1965 Harol Flor, một nhà bệnh cây học người Mỹ, khi nghiên cứu bệnh gỉ sắt trên cây lanh (Melamspora lini) đã đưa ra thuyết gen đối gen. For each gene that conditions resistance in the host there is a corresponding gene that conditions pathogenicity in the parasites - đối với mỗi gen quy định tính kháng trên cây ký chủ thì có một gen tương ứng quy định tính gây bệnh trong ký sinh.

o Năm 1963, Vanderplank cho biết có 2 loại tính kháng:

§ Tính kháng dọc (vertical resistance) được điều khiển bởi một hoặc một vài gen kháng chủ "major" resistance gene có tính kháng cao, nhưng chỉ chống được một hoặc một vài chủng tác nhân gây bệnh.

§ Tính kháng ngang (horizontal resistance) được điều khiển bởi nhiều gen kháng thứ "minor" resistance gene có tính kháng yếu nhưng kháng được tất cả các chủng sinh lý.

Câu 2: So sánh miễn dịch thực vật và miễn dịch động vật. Định nghĩa 2 loại tính kháng bệnh và tính chịu bệnh?

1        So sánh miễn dịch thực vật và miễn dịch động vật:

o Giống nhau:

§ Ở mức độ phân tử và tế bào: phản ứng phòng thủ của thực vật và động vật chia sẻ nhiều điểm chung mà quan trọng nhất là quá trình nhận biết và khởi động phản ứng kháng hay miễn dịch.

§ Các tế bào đều có khả năng nhận biết được các tác nhân vi sinh vật ngoại lai là do các tác nhân vi sinh vật đều hình thành các phân tử gọi là mô hình phân tử MAMP/PAMP. Và các MAMP/PAMP này khá bảo thủ.

-     MAMP: Microbe associated molercular pattern

-     PAMP: Pathogen associated molercular pattern

à Một số ví dụ như: LPS (Lipopolysaccharide) ở vi khuẩn Gram (-); Peptidoglycan của vi khuẩn Gram (+); Flagellin của lông roi vi khuẩn; Chitin, glucan của vách tế bào nấm; Các Avr Protein (Avirulence) của các tác nhân gây bệnh cây.

§ Các receptor nhận biết các MAMP/PAMP khá giống nhau ở động vật và thực vật, ký hiệu là PRR - Pattern Recognition Receptor.

-     PRR của động vật là các protein như Toll của ruồi giấm hay Toll Like Receptor (TLR) của động vật máu nóng.

-     PRR của thực vật là các protein kháng (Protein R) như FLS2, Cf9 hay Xa21...

-     Các PRR này đều có các đặc điểm chung như:

·    Về đặc điểm cấu trúc:

ü Đều có vùng lặp giàu Leucine ở đầu C (gọi là vùng LRR - Leucine Rich Repeats) - là vùng nhận biết các MAMP/PAMP.

ü Và vùng TIR - Toll_Interleukin 1 Receptor ở đầu N

·    Về đặc điểm chức năng: nhận biết các MAMP/PAMP và khởi động phản ứng miễn dịch/kháng kháng bẩm sinh.

o Khác nhau: Động vật máu nóng có hệ miễn dịch còn thực vật thì không có. Hệ miễn dịch bao gồm các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch và các tế bào có thẩm quyền miễn dịch.

§ Các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch như tuyến ức, lách, tủy... là nơi sản sinh, duy trì, biệt hóa và điều khiển hoạt động của các tế bào có thẩm quyền miễn dịch.

§ Các tế bào có thẩm quyền miễn dịch chủ yếu là lympho bào B và lympho bào T tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch của cơ thể nhằm chống lại các tác nhân lạ xâm nhập vào cơ thể. Có hai kiểu đáp ứng miễn dịch như sau:

-     Kiểu đáp ứng miễn dịch dịch thể:

·    Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể sẽ lập tức bị đại thực bào vây bắt, xử lý và trình diện cho lympho bào T.

·    Lympho bào T được biến đổi trở thành trợ bào T.

·    Trợ bào T giúp biến đổi lympho bào B thành tế bào plasma sản xuất ra kháng thể dịch thể Ig (Immuno globulin) bao gồm 5 lớp là IgG, IgA, IgM, IgE, IgD.

·    Các kháng thể dịch thể tồn tại trong dịch cơ thể (huyết tương) và kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên,

·    Một số ít trường hợp, kháng nguyên có thể kích thích trực tiếp lympho bào B thành tế bào plasma

-     Kiểu đáp ứng miễn dịch tế bào:

·    Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể bị đại thực bào vây bắt, xử lý và trình diện cho lympho bào T.

·    Lympho bào T được biệt hóa thành lympho bào T mẫn cảm với kháng nguyên và chính bản thân chúng là kháng thể tế bào.

2        Định nghĩa 2 loại tính kháng bệnh và tính chịu bệnh:

o Tính kháng bệnh (resistance): Là khả năng của cây loại bỏ hoặc khắc phục hoàn toàn, hoặc ở mức độ nào đó ảnh hưởng của tác nhân gây bệnh hoặc của các yếu tố gây hại.

§ Tính kháng ký chủ:

-     Tính kháng không đặc hiệu chủng: tính kháng ngang, số lượng, gen thứ, đa gen, đồng ruộng à tính kháng được điều khiển bởi nhiều gen có ảnh hưởng nhỏ đến tính kháng, có tính kháng yếu nhưng kháng được hầu hết các kiểu gen của một tác nhân gây bệnh. Kiểu gen của cây ký chủ biến động liên tục biểu hiện tính kháng từ rất nhẹ đến khá kháng. Và tính kháng này được biểu hiện tốt nhất trên đồng ruộng.

-     Tính kháng đặc hiệu chủng: tính kháng dọc, chất lượng, gen chủ, đơn gen à được điều khiển bởi một hoặc một vài gen có ảnh hưởng lớn đến sự biểu hiện tính kháng, có tính kháng cao nhưng chỉ kháng được một số kiểu gen (chủng, nòi) của tác nhân gây bệnh. Kiểu gen của cây ký chủ có thể dễ dàng phân biệt giữa dạng kháng và dạng mẫn cảm

§ Tính kháng phi ký chủ: còn gọi là tính kháng cơ bản, tác nhân gây bệnh và cây ký chủ tương tác không tương hợp với nhau

§ Ngoài ra còn một vài khái niệm tính kháng khác như:

-     Tính kháng bẩm sinh: là một dạng tính kháng do tiềm năng di truyền qui định.

-     Tính kháng tạo được: là dạng tính kháng hình thành hoặc cục bộ hoặc hệ thống trên cây ký chủ mẫn cảm khi bị kích thích bởi tác nhân gây bệnh hoặc các yếu tố vô sinh.

-     Tính kháng cả đời: biểu hiện tính kháng ở tất cả giai đoạn của cây.

-     Tính kháng mô trưởng thành: ở một số loài mô già hoàn toàn kháng bệnh

-     Tính kháng cây trưởng thành: biểu hiện kháng khi cây trưởng thành (do gen chủ đặc hiệu chủng điều khiển).

-     Tính kháng bền vững: duy trì trong thời gian lâu dài dưới tác động của tác nhân gây bệnh.

-     Tính kháng ổn định: biểu hiện ở nhiều điệu kiện sinh trưởng khác nhau.

-     Tính kháng biểu kiến: trong nhiều trường hợp tương tác giữa cây ký chủ và tác nhân gây bệnh tương hợp nhau (thậm chí cấy ký chủ rất mẫn cảm) nhưng cây có thể không bị nhiễm bệnh, hoặc có nhiễm bệnh nhưng không biểu hiện triệu chứng hoặc triệu chứng không đáng kể

o Tính chịu bệnh: là một thành phần trong tính kháng biểu kiến à tính chịu bệnh chính là khả năng của cây bị nhiễm bệnh nhưng không bị ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng và sinh sản, đặc biệt là trong trường hợp này cây không biểu hiện bất kỳ phản ứng kháng bệnh nào.

Câu 3: Nêu đặc điểm xâm nhập của nấm, vi khuẩn và virus vào trong cây. Đặc điểm dinh dưỡng gây bệnh của mỗi nhóm?

3        Đặc điểm xâm nhập và dinh dưỡng gây bệnh của nấm:

o Đặc điểm chung của nấm gây bệnh:

§ Trên 80% số bệnh hại cây trồng là do nấm bệnh gây ra.

§ Phần lớn nấm có cơ quan sinh trưởng là sợi nấm có cấu tạo dạng sợi, hợp thành một tản nấm.

§ Sợi nấm đa bào hoặc đơn bào, phân nhánh.

§ Không có diệp lục, dị dưỡng.

§ Sinh sản tạo ra bào tử.

§ Tế bào sợi nấm có vách tế bào (glucan, chitin), nhân. Tế bào chất có không bào và các bào quan.

o Đặc điểm xâm nhập của nấm:

§ Nấm có thể xâm nhập vào cây bằng sợi nấm hay bào tử, phần lớn nấm xâm nhập vào cây bằng bào tử. Trước khi xâm nhập bào tử phải tiếp xúc với bề mặt ký chủ, gặp điều kiện thuận lợi (nhiệt độ, độ ẩm) bào tử nấm nảy mầm thành ống mầm. Tùy từng lại nấm mà nấm có thể xâm nhập vào bên trong cây trực tiếp hoặc gián tiếp.

-     Xâm nhập trực tiếp (chủ động):

·    Bào tử của một số loại nấm, ví dụ bào tử động Phytophthora, Plasmodiophora brassicae nảy mầm thành ống mầm xâm nhập trực tiếp qua bề mặt rễ.

·    Bào tử một số loại nấm, ví dụ bào tử phân sinh nấm Alternaria nảy mầm thành ống mầm xâm nhập trực tiếp qua tầng cutin của lá.

à Trong qua trình xâm nhập trực tiếp, nấm luôn tiết ra enzyme để làm mềm bề mặt và tạo điều kiện thuận lợi cho sự nảy mầm.

1        Đối với một số loại nấm, ví dụ Pyricularia oryzae, Colletotrichum, Oidium bào tử nảy mầm thành ống mầm. Đầu ống mầm hình thành một cấu trúc đặc biệt gọi là giác bám hay còn gọi là vòi bám/vòi áp/đĩa áp (appressorium). Trên giác bám hình thành đế xâm nhập hay còn gọi là vòi xâm nhập/móc xâm nhập (penetration peg) đâm xuyên qua bề mặt ký chủ gồm tầng cutin và vách tế bào. Giác bám tích lũy nhiều carbonhydrate (chủ yếu là glycerol) à tạo áp lực thẩm thấu cao, giúp hút nước từ bên ngoài vào trong giác bám, tạo một áp suất trương lớn (như giác bám của nấm phấn trắng tạo áp suất trương khoảng 20-40atm, của Pyricularia oryzae khoảng 80atm, trong khi của lốp xe ô tô chỉ khoảng 2-3atm). Áp suất trương cao cho phép nấm xâm nhập qua bề mặt ký chủ bằng đế xâm nhập dễ dàng. Mặc dù sự xâm nhập bằng giác bám và đế xâm nhập là do lực cơ học nhưng nấm cũng tiết ra các enzyme nhằm hỗ trợ cho sự xâm nhập như cellulose, pectinase. Trong nhiều trường hợp, ví dụ nấm đạo ôn, sự xâm nhập chỉ có thể xảy ra nếu giác bám tích lũy sắc tố đen (melanin). Melanin sẽ làm cho vách giác bám vững chắc, không bị vỡ khi giác bám hút nước để tạo áp suất trương lớn.

-     Xâm nhập gián tiếp (thụ động):

2        Qua lỗ mở tự nhiên: một số loại nấm sẽ xâm nhập vào cây qua lỗ mở tự nhiên như khí khổng, thủy khổng, bì khổng. Ví dụ bào tử nấm Cercospora, bào tử nấm gỉ sắt, nảy mầm thành ống mầm và xâm nhập vào cây qua khí khổng.

3        Qua các vết thương cơ giới, các vết nứt tự nhiên: Một số loại nấm có thể xâm nhập qua các tổn thương cơ giới hoặc các vết nứt tự nhiên. Ví dụ bào tử nấm Fusarium oxysporum nảy mầm thành ống mầm và xâm nhập qua vết nứt hình thành khi rễ bên nhú ra từ rễ chính.

* Chú ý: Nhiều loại nấm có thể xâm nhập vào cây theo cả hai hình thức chủ động và thụ động.

o Dinh dưỡng gây bệnh của nấm:

§ Nhóm tạo vòi hút: để hấp thụ dinh dưỡng, nhiều loài, chủ yếu thuộc nhóm sinh dưỡng bắt buộc (obligate biotroph) như sương mai, gỉ sắt, phấn trắng hoặc một số loài thuộc nhóm bán sinh dưỡng (semi-biotroph) như Pyricularia oryzae, Pseudomonas syringae tạo ra cấu trúc gọi là vòi hút (haustorium) bên trong tế bào ký chủ để hấp thụ dinh dưỡng. Các nấm thuộc nhóm sinh dưỡng thường không giết chết tế bào, còn các nấm thuộc nhóm bán sinh dưỡng thì giết chết tế bào về sau

§ Nhóm không tạo vòi hút: Các nhóm nấm hoại dưỡng (necrotroph) như Rhizoctonia, Sclerotium thường không tạo thành vòi hút mà ngay trong quá trình xâm nhập, chúng tiến hành phân hủy tế bào và mô ký chủ bằng enzyme và độc tố.

4        Đặc điểm xâm nhập và dinh dưỡng gây bệnh của vi khuẩn:

o Đặc điểm xâm nhập của vi khuẩn:

§ Mặc dù vi khẩn có khả năng di chuyển bằng lông roi trong màng nước, nhưng do không có khả năng tự xuyên thủng bề mặt nguyên vẹn của ký chủ nên phần lớn vi khuẩn xâm nhập vào cây hoàn toàn thụ động qua các lỗ mở tự nhiên như khí khổng, thủy khổng, bì khổng hoặc qua các vết thương cơ giới trên lá, rễ. Trên lá, điều kiện màng nước là hoàn toàn cần thiết để giúp vi khuẩn có thể di chuyển tới lỗ mở.

§ Một số vi khuẩn lan truyền nhờ vector sẽ xâm nhập vào cây nhờ vector như vi khuẩn Erwinia tracheiphila xâm nhập nhờ bọ cánh cứng Acalymma vittata.

§ Một số loài vi khuẩn biệt dưỡng cũng xâm nhập vào cây nhờ vector như Candidatus liberobacter asiaticus xâm nhập vào cây nhờ rầy chống cánh Diaphorina citri.

o Dinh dưỡng gây bệnh của vi khuẩn: Sau khi xâm nhập vào trong mô vi khuẩn không hình thành bất cứ một cấu trúc đặc biệt nào để hấp thụ dinh dưỡng. Do vậy, vi khuẩn sẽ sử dụng các enzyme và độc tố để phân hủy tế bào ký chủ và vật chất hữu cơ để hấp thụ qua màng tế bào, ngoài ra việc tiết ra các enzyme và độc tố còn có tác dụng giúp vi khuẩn khắc phục tính kháng của cây ký chủ.

5        Đặc điểm xâm nhập và dinh dưỡng gây bệnh của virus:

o Đặc điểm xâm nhập của virus: mặc dù nhiều loài virus có thể xâm nhập vào cây nhờ tổn thương cơ giới (thí dụ có thể sử dụng bột carbonduraan thổi lên bề mặt lá sau đó lấy dung dịch chứa virus bôi lên bề mặt lá và cọ sát nhẹ lớp bột sẽ tạo ra vết thương cơ giới) thì ngoài tự nhiên hầu hết virus xâm nhập vào cây nhờ vector (môi giới truyền bệnh chích nạp trực tiếp virus từ cây bệnh sang cây khỏe mạnh).

o Dinh dưỡng gây bệnh của virus: Virus có hình thức dinh dưỡng đặc biệt hơn so với nấm và vi khuẩn. Vì số lượng gen mã hóa bởi virus rất ít nên quá trình tái sinh virus phụ thuộc vào vật liệu (amino acid, nucleotide), bộ máy tổng hợp acid nucleotide, năng lượng (chủ yếu dưới dạng các hợp chất cao năng như ATP), bộ máy dịch mã (ribosome, tRNA, các enzyme liên quan) của tế bào ký chủ. Cần chú ý là ngoài sự dụng tài nguyên của tế bào ký chủ thì quan trọng hơn, virus gây bệnh cây nhờ tương tác giữa protein virus (mặc dù ít) với các chất chịu trách nhiệm cho chức năng sinh lý của tế bào ký chủ.

§ Như Protein replicase của virus TMV (Tobacco mosaic virus) tương tác với protein Aux/IAA của tế bào ký chủ chịu trách nhiệm điều hòa các phản ứng sinh hóa qua đường hướng dẫn truyền auxin.

§ Protein Rep của geminivirus tương tác với protein tương tự Retinoblastoma (pRBR) của tế bào ký chủ, chịu trách nhiệm điều khiển chu kỳ tế bào.

Câu 4: Đặc điểm độc tố của tác nhân gây bệnh. Khái niệm độc tố chọn lọc ký chủ và độc tố không chọn lọc ký chủ. Mô tả đặc điểm của một loại độc tố chọn lọc ký chủ và một loại độc tố không chọn lọc ký chủ?

1        Đặc điểm độc tố của tác nhân gây bệnh (chủ yếu là của nấm và vi khuẩn): trong quá trình gây bệnh, tác nhân gây bệnh có thể tiết ra một số chất gây độc cho tế bào và mô ký chủ gọi là độc tố. Độc tố có một số đặc điểm sau:

§ Không có bản chất enzyme nhưng đa dạng về thành phần và cấu trúc hóa học.

§ Tác động lên tế bào ở nồng độ rất thấp.

§ Thường do tác nhân gây bệnh tổng hợp trên cây, nhưng cũng có thể tổng hợp trên môi trường nhân tạo.

§ Tác động lên nhiều chức năng sinh lý của tế bào, chủ yếu thong qua sự tương tác với các enzyme chức năng của tế bào.

§ Độc tố có thể đóng vai trò như tác nhân qui định tính độc (còn gọi là yếu tố độc) tác động phụ thuộc số lượng và làm thay đổi triệu chứng. Độc tố cũng có thể đóng vai trò như tác nhân qui định tính gây bệnh (còn gọi là yếu tố gây bệnh) tác động phụ thuộc chất lượng (có nghĩa phụ thuộc sự có mặt hay không có mặt của độc tố).

§ Phần lớn là nấm và vi khuẩn thuộc nhóm hoại dưỡng (necrotroph), một số cũng gây hại cho động vật.

§ Chức năng: Giết chết tế bào để (1) giải phóng dinh dưỡng cần cho tác nhân gây bệnh hoặc (2) ngăn cản tế bào thực hiện các phản ứng phòng thủ.

Trong bệnh cây độc tố của tác nhân gây bệnh chia làm hai nhóm chính là:

1        Độc tố không chọn lọc ký chủ (nonhost-selective or nonhost-specific toxin)

§ Là loại độc tố không chỉ tác động lên loài cây ký chủ của tác nhân gây bệnh mà còn tác động lên nhiều loài cây khác không phải ký chủ của tác nhân gây bệnh à tác động không chọn lọc.

§ Thường là yếu tố độc nghĩa là làm tăng tính độc của tác nhân gây bệnh (tăng mức độ biểu hiện của triệu chứng).

§ Về cơ chế tác động: một số độc tố (vd: tabtoxin, phaseolotoxin) ức chế enzyme của tế bào ký chủ dẫn tới sự tích lũy các chất tới mức gây đầu độc tế bào hoặc làm thiếu hụt nghiêm trọng các chất cần thiết cho tế bào.

§ Ví dụ:

o Tabtoxin: do vi khuẩn Pseudomonas syringae pv.tabaci gây bệnh đốm cháy thuốc lá (wildfire). Một số chủng (gọi là các chủng tạo độc tố) của vi khuẩn này tạo vết đốm với quầng vàng trên thuốc lá. Dịch lọc vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường nhân tạo hoặc độc tố tinh chiết ra cũng biểu hiện triệu chứng tương tự không chỉ trên cây thuốc lá mà còn trên nhiều loài cây thuộc nhiều họ thực vật khác nhau. Một số chủng bị đột biến mất khả năng tạo tabtoxin (ký hiệu là chủng Tox -) có tính độc giảm và tạo ra vết đốm chết hoại và không có quầng vàng. Tabtoxin là một dipeptide gồm 2 amino acid (threonin và tabtoxinin). Bản thân tabtoxin không độc nhưng ở trong tế bào, tabtoxin bị thủy phân thành tabtoxinin và threonin. Tabtoxin là một chất độc vì nó làm bất hoạt "Glutamine synthetase" (enzyme cần thiết cho sự tổng hợp glutamine từ glutamate và NH3) à dẫn tới suy giảm nghiêm trọng lượng glutamine trong tế bào đồng thời tích lũy quá nhiều NH3. Hậu quả của việc tích lũy NH3 là tế bào không kết hợp giữa quang hợp và quang hô hấp (hay mất khả năng cố định CO2), phá hủy màng tế bào lục lạp dẫn tới tạo đốm biến vàng và cuối cùng mô bị chết hoại (có quầng vàng bao quanh). Tabtoxin cũng làm giảm khả năng phản ứng chủ động của cây đối với vi khuẩn.

o Phaseolotoxin: do vi khuẩn Pseudomonas syringae pv.phaseolicola gây bệnh đốm quầng (halo-blight) đậu đỗ. Cây nhiễm bệnh hay được xử lý với phaseolotoxin đều cho triệu chứng giống nhau như: giảm sinh trưởng lá, phá vỡ mô đỉnh, tích lũy quá mức ornithin (một loại amino acid). Phaseolotoxin là một tripeptide gồm 3 amino acid (ornithine-alanine-arginine) chứa một nhóm phosphosulfinyl. Ngay khi vi khuẩn tiết ra phaseolotoxin, enzyme của cây sẽ cắt các liên kết peptide và giải phóng alanine, arginine và phosphosulfinyl-ornithine (là một hợp chất có hoạt tính sinh học). Độc tố có ảnh hưởng đến tế bào bằng cách bất hoạt enzyme ornithine carbamoyltransferase chịu trách nhiệm chuyển hóa ornithin thành citruline - tiền chất của arginine. Hậu quả là tế bào tích lũy quá mức ornithine, suy giảm nghiệm trọng citruline và arginine. Phaseolotoxin còn ảnh hưởng tới tổng hợp pyrimidine, giảm hoạt tính ribosome, tương tác với quá trình tổng hợp lipid, thay đổi tính thấm của màng và tích lũy tinh bột trong lục lạp.

o Tentoxin: do nấm Alternaria alternata (gây đốm và biến vàng trên nhiều loại cây) tạo ra. Tentoxin là một tetrapeptide vòng tương tác với một protein liên quan đến dẫn truyền năng lượng vào lục lạp (Chloroplast F(1) - ATPase/ CF(1)). Độc tố gây ức chế quá trình quang phosporyl hóa (photophosphorylation). Ở những loài cây mẫn cảm, tentoxin còn ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của lục lạp dẫn tới mô bị biến màu do mất khả năng tổng hợp chlorophyll. Ngoài ra, tentoxin còn ức chế hoạt tính của polyphenol oxydase cần cho phản ứng phòng thủ của cây.

o Cercosporin: do nấm Cercospora tiết ra. Nấm Cercospora gây nhiều bệnh đốm lá trên cây (ví dụ nấm Cercospora nicotianae gây bệnh đốm mắt của trên thuốc lá). Cercosporin là một perylenequinon chỉ gây độc cho tế bào khi được hoạt hóa bởi ánh sang.

Cercospora hấp thu năng lượng ánh sáng mặt trời để trở thành trạng thái hoạt hóa. Cercosporin hoạt hóa sẽ phản ứng với oxy để tạo ra các lớp oxy hóa độc đối với tế bào (ví dụ peroxyde O2- oxy hóa lipid của màng tế bào).

2        Độc tố chọn lọc ký chủ (host-selective or host-specific toxin)

§ Tác động chọn lọc: chỉ tác động đến loài cây ký chủ của tác nhân gây bệnh

§ Thường là yếu tố gây bệnh nghĩa là tác nhân gây bệnh chỉ có thể gây bệnh cùng với sự có mặt của độc tố do nó tiết ra.

§ Một vài ví dụ:

o Victorin (HV toxin): do nấm Cochliobolus victoriae tổng hợp nên và gây bệnh trên cây đại mạch. Nấm bệnh xuất hiện tại Mỹ năm 1945 và gây bệnh trên cây đại mạch Victoria. Chỉ có chủng nấm tạo HV toxin mới có khả năng gây bệnh trên giống đại mạch này. Victorin là một pentapeptide gây hại màng tế bào ký chủ, ức chế enzyme glycine decarboxylase do đó ảnh hưởng đến quang hô hấp của tế bào.

o T toxin: do chủng T của nấm Bipolaris maydis (Cochliobolus heterostrophus) tạo ra, gây bệnh đốm lá nhỏ trên ngô. Chủng T của nấm chỉ nhiễm trên dòng ngô bất dục đực tế bào chất. T toxin là một họ các phân tử polyketide có từ 35-47 gốc C (chủ yếu là 39 hoặc 41 C), tấn công ty thể và ức chế tổng hợp ATP. T toxin tương tác với protein là URF13 nằm phía trong màng ty thể, hình thành các lỗ trên màng ty thể dẫn tới làm mất tính thấm của ty thể. URF13 (do gen T-urf13) chỉ có ở dòng ngô bất dục đực tế bào chất.

Câu 5: Vai trò của hormone thực vật trong bệnh cây. Mô tả vai trò của hormone thực vật trong quá trình gây bệnh cây?

Tác nhân gây bệnh có thể gây bệnh cây thông qua các hormone thực vật. Các tác nhân gây bệnh có thể trực tiếp hoặc gián tiếp kích thích cây tổng hợp hormone thực vật. Ngoài ra, tác nhân gây bệnh cũng có thể tương tác với các chất tham gia quá trình tổng hợp hormone trong tế bào cây và làm biến đổi cân bằng hormone dẫn tới hình thành triệu chứng.

3        Auxin: điển hình nhất là Indol-3-acetic acid (IAA), cần cho sự kéo dài và biệt hóa của tế bào cây. IAA có thể ảnh hưởng đến tính thấm của màng tế bào, tăng hô hấp và thúc đẩy tổng hợp protein. Nồng độ IAA trong cây tăng lên là do 3 lý do:

Một số ví dụ

§ Nấm Ustilago maydis gây bệnh ung thư ngô

§ Nấm Plasmodiophora brassicae gây bệnh sưng rễ cây thập tự.

§ Vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cà chua, khoai tây. Vi khuẩn cảm ứng cây hình thành IAA (với nồng độ có thể gấp 100 lần). Trong trường hợp này, mặc dù không có sự biến đổi nhiều về hình thái của cây, nhưng hàm lượng IAA cao giúp cho các enzyme của vi khuẩn dễ dàng xâm nhập qua vách và màng tế bào cây.

§ Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens gây bệnh sưng u nhiều loại cây. Vi khuẩn sẽ chuyển gen tổng hợp auxin (và các chất sinh trưởng khác) nằm trên vùng T-DNA của Ti-plasmide vào genome của cây.

§ TMV: protein tái sinh (Rep protein) của TMV tương tác với protein Aux/IAA (điều khiển sự cân bằng auxin của cây) dẫn tới hình thành các triệu chứng.

4        Gibberellins: là hormone thực vật có tác dụng thúc đẩy sự ra hoa, kích thích sự kéo dài của thân và rễ, tăng trưởng quả... Gibberellins là một nhóm gồm khoảng 80 hợp chất trong đó gibberellic acid (GA3) là quan trọng nhất.

§ Một số tác nhân gây bệnh có thể tự tổng hợp được gibberellin. Ví dụ nấm Giberrella fujikuroi (Fusarium moniliforme) gây bệnh lúa von trên lúa.

§ Một số tác nhân có thể tương tác với các thành phần của ký chủ làm biến đổi hàm lượng gibberellin trong cây. Ví dụ Rice dwaft virus (RDV) là một virus gây bệnh lùn cây và lá màu xanh lục tối trên lúa. Protein P2 (là protein vỏ capside) của RDV tương tác với ent-kaurene oxydase của cây lúa. Ent-kaurene oxydase là enzyme chính chịu trách nhiệm tổng hợp gibberellin trong cây. Cây lúa bị nhiễm RDV có hàm lượng GA1 giảm rõ rệt và xử lý GA3 có thể làm mất triệu chứng lùn cây.

§ Tác nhân gây bệnh ức chế enzyme IAA oxidase dẫn tới IAA được hình thành tự nhiên trong cây không bị kiểm soát về nồng độ.

§ Tác nhân gây bệnh kích thích cây tạo nhiều IAA.

§ Tác nhân gây bệnh tự tổng hợp được IAA.

            Cytokinin: (điển hình là kinetin và zeatin) là hormone thực vật chịu trách nhiệm kích thích phân chia tế bào, chống già hóa, liên kết với ribosomes và điều khiển tổng hợp protein. Cytokinin cũng là receptor trên màng tế bào. Cytokinin được biết là tham gia trong quá trình hình thành các khối u do nấm Taphrina deforman (gây bệnh xoăn lá đào) và nấm Plasmodiophora brassicae (gây bệnh sưng rễ bắp cải).

Ethylene: được tạo ra tự nhiên trong cây và có ảnh hưởng tới nhiều chức năng sinh lý trong cây bao gồm biến vàng, rụng lá, kích thích hình thành rễ bên, thúc đẩy sự chín của quả. Trong bệnh cây, ethylene có một vai trò kép. Một mặt ethylene là phân tử dẫn truyền tín hiệu để thúc đẩy tính kháng của cây. Mặt khác ethylene là yếu tố độc, chịu trách nhiệm tăng cường triệu chứng hoặc khả năng phát triển của tác nhân gây bệnh. Ví dụ dòng vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. glycinea đột biến mất khả năng hình thành ethylene sẽ không thể phát triển tốt trên lá đậu. Nhiều tác nhân gây bệnh kích thích cây hình thành nhiều ethylene và tạo ra một số triệu chứng như epinasty (ngọn, thân, lá bị cuốn cong gập xuống). Ví dụ ethylene chịu trách nhiệm về triệu chứng epinasty và rụng lá trên cây bông nhiễm nấm Verticillium dahliae, các triệu chứng biến vàng, còi cọc do nhiễm Cucumber mosaic virus.

Câu 6: Phân loại tác nhân gây bệnh theo tính ký sinh và phương thức sử dụng nguồn thức ăn (dinh dưỡng). Ví dụ mỗi loại?

            Có thể xem quan hệ của các tác nhân gây bệnh với cây ký chủ là quan hệ ký sinh (parasitic). Quan hệ ký sinh là quan hệ mà một sinh vật sẽ được hưởng lợi còn sinh vật kia bị gây hại. Dựa theo mức độ ký sinh trên cây, tác nhân gây bệnh cây có thể được chia làm 3 nhóm là ký sinh chuyên tính, bán ký sinh, bán hoại sinh. Một nhóm nữa, không gây bệnh cho cây nhưng cũng được xét đến đó là nhóm hoại sinh.

§ Ký sinh chuyên tính (obligate parasite): chỉ có thể gây bệnh trên mô và tế bào sống. Ví dụ là nấm gỉ sắt, phấn trắng, sương mai, phytoplasma hoặc virus. Các ký sinh chuyên tính, nhìn chung không thể nuôi cấy trên môi trường nhân tạo.

§ Bán ký sinh (hay còn gọi là hoại sinh có điều kiện - facultative saprophyte): sống ký sinh trên tế bào sống là chủ yếu nhưng vẫn có khả năng sống trên tàn dư, mô suy nhược hoặc đã chết. Ví dụ điển hình là nhiều loại nấm túi Cercospora (gây các bệnh đốm lá).

§ Bán hoại sinh (hay còn gọi là ký sinh có điều kiện - facultative parasite): chủ yếu sống trên tế bào suy nhược, đã chết, trên tàn dư cây trồng, trên đất, trên hạt, quả, nhưng có thể ký sinh trên tế bào sống. Ví dụ nấm mốc đen Rhizopus, nấm chổi Penicillium, nấm Botrytis.

§ Hoại sinh (saprophyte): chỉ có thể sống ở trên các tế bào đã chết, tàn dư, đất. Các loại này đóng một vai trò quan trọng trong việc phân hủy các vật chất hữu cơ trong đất trồng. Một số là vi sinh vật đối kháng có thể được sử dụng trong việc phòng ngừa bệnh cây (biện pháp sinh học) như nấm Trichoderma.

3        Theo phương thức sử dụng nguồn dinh dưỡng, tác nhân gây bệnh có thể được chia thành 3 nhóm:

§ Nhóm sinh dưỡng (biotroph): Sử dụng nguồn thức ăn từ mô ký chủ sống. Các ví dụ điển hình là nấm sương mai (Phytophthora parasitica), gỉ sắt và phấn trắng (Erysiphe cichoracearum). Nhóm sinh dưỡng, nhìn chung có phổ ký chủ hẹp và không giết chết tế bào ký chủ ngay sau khi xâm nhiễm; mà thay vào đó chúng để tế bào ký chủ sống càng lâu càng tốt vì chúng phụ thuộc vào quá trình trao đổi chất nguyên vẹn của tế bào ký chủ để thực hiện quá trình dinh dưỡng và sinh sản. Điều này tạo cơ hội cho ký chủ có thể thiết lập được các phản ứng phòng thủ có liên quan đến gen kháng. Đối với nấm thuộc nhóm sinh dưỡng, phương thức hấp thụ dinh dưỡng thường được thực hiện nhờ vòi hút (haustorium). Mô bị chết hoại hình thành chỉ sau khi nấm đã hoàn thành quá trình sinh sản.

§ Nhóm hoại dưỡng (necrotroph): Sử dụng nguồn thức ăn từ mô chết hoặc đang chết. Các ví dụ điển hình là nấm Botrytis cinerea, Alternaria brassicicola, Rhizoctonia solani. Nhóm hoại dưỡng, nhìn chung có phổ ký chủ rộng hơn nhiều và ngay sau khi xâm nhiễm, chúng ngay lập tức giết chết tế bào ký chủ rất sớm và tạo ra một loạt các độc tố mà chúng dường như thúc đẩy tế bào chết. Vì tế bào ký chủ chết rất sớm nên nhìn chung tế bào không đủ thời gian để thiết lập các phản ứng phòng thủ thông qua gen kháng. Tuy nhiên, từ các mô xung quanh vết chết hoại có thể tạo được phản ứng kháng nhờ các chất khuếch tán từ vết bệnh.

§ Bán sinh dưỡng (semi-biotroph): Một số vi sinh vật có kiểu sinh dưỡng hỗn hợp. Ví dụ vi khuẩn Pseudomonas syringae có lúc được xem như thuộc nhóm sinh dưỡng, có lúc được xem như thuộc nhóm hoại dưỡng. Vi khuẩn xâm nhập vào cây qua tổn thương cơ giới hoặc khí khổng. Trong giai đoạn đầu của sự nhiễm bệnh vi khuẩn không giết chết tế bào ký chủ, nhưng về sau vi khuẩn lại giết chết tế bào ký chủ.

Câu 7: Nêu đặc điểm phòng thủ thụ động của cây?

Nhìn chung cây chống lại tác nhân gây bệnh nhờ kết hợp các vũ khí từ hai kho vũ khí là: các đặc điểm cấu trúc: có vai trò là các rào cản vật lý ngăn cản tác nhân gây bệnh xâm nhập vào và phát triển trong cây và các phản ứng sinh hóa: xảy ra trong tế bào và mô cây, hình thành các chất hoặc là độc đối với tác nhân gây bệnh hoặc tạo điều kiện ức chế sự sinh trưởng của tác nhân gây bệnh. Sự kết hợp hai kho vũ khí này khác nhau tùy thuộc vào tổ hợp ký sinh-ký chủ. Ngoài ra, thậm chí cùng kiểu ký sinh-ký chủ thì sự kết hợp này cũng khác nhau tùy thuộc tuổi cây, loại cơ quan hoặc mô bị tấn công, điều kiện dinh dưỡng của cây hoặc điều kiện thời tiết. Các vũ khí cấu trúc và hóa học thuộc cơ chế phòng thủ thụ động của cây thường có sẵn từ trước và không đặc hiệu.

            Phòng thủ nhờ rào cản vật lý có sẵn: Nhìn chung phòng tuyến đầu tiên là bề mặt cây ký chủ, nơi tác nhân gây bệnh tiếp xúc và xâm nhập. Các đặc điểm cấu trúc bề mặt ảnh hưởng tới sự tiếp xúc và xâm nhập của tác nhân gây bệnh bao gồm:

§ Lớp sáp: tạo ra bề mặt ghét nước, do đó ngăn cản sự hình thành màng nước cần cho bào tử nấm tiếp xúc, nảy mầm và vi khuẩn nhân lên. Mật độ lông lá dày cũng có ảnh hưởng tương tự và cũng có thể làm giảm sự nhiễm bệnh.

§ Tầng cutin: có khả năng ngăn cản các tác nhân gây bệnh có kiểu xâm nhập trực tiếp. Tuy nhiên, độ dày tầng cutin không luôn luôn quan hệ tỉ lệ thuận với tính kháng.

§ Lớp tế bào biểu bì: Độ dày và độ cứng của vách tế bào biểu bì dường như là một yếu tố quan trọng đối với tính kháng của một vài tổ hợp ký sinh-ký chủ. Vách dày và cứng của tế bào biểu bì có thể ngăn cản sự xâm nhập trực tiếp của tác nhân gây bệnh. Cây có đặc điểm này thường biểu hiện tính kháng, nhưng trong trường hợp tác nhân gây bệnh được đưa vào các mô bên dưới nhờ tổn thương cơ học thì tính kháng này không được biểu hiện.

§ Đặc điểm khí khổng: Một vài loài nấm và vi khuẩn chỉ có khả năng xâm nhập qua khí khổng, mặc dù phần lớn chúng có khả năng xâm nhập qua khí khổng đóng, nhưng đối với một vài loài như nấm gỉ sắt thân lúa mỳ chỉ có khả năng xâm nhập qua khí khổng mở. Chính vì vậy một số giống lúa mỳ có khí khổng mở muộn trong ngày là kháng bệnh vì ống mầm của bào tử nấm (hình thành nhờ sương đêm) sẽ bị khô trước khi khí khổng mở. Ngoài ra, khí khổng với cấu tạo lỗ mở hẹp cũng có khả năng ngăn cản sự xâm nhập của vi khuẩn.

§ Tế bào bên trong: Vách tế bào của mô đang bị xâm nhập thường thay đổi độ dày và độ cứng, đôi khi cũng ức chế sự phát triển cả bệnh. Sự có mặt của nhiều tế bào cương mô trong thân của nhiều loại ngũ cốc có thể hạn chế sự phát triển của một số bệnh như bệnh gỉ sắt hại thân. Ngoài ra, các tế bào xylem, bó bẹ (bundle sheat), cương mô của gân lá cũng giới hạn sự phát triển của một số bệnh đốm lá do nấm, vi khuẩn, một số loại tuyến trùng và tạo ra các vết bệnh ở góc cạnh. Tế bào xylem dường như liên quan trực tiếp hơn đến mức độ kháng hay mẫn cảm của các loại bệnh hại mạch dẫn. Ví dụ, đường kính tế bào, tỉ lệ tế bào mạch xylem có kích thước lớn có mối tương quan thuận với độ mẫn cảm của cây du (elm) do nấm Ophiostoma novo-ulmi.

            Phòng thủ nhờ các chất hóa học có sẵn: Mặc dù rào cản vật lý có khả năng tạo ra một số mức độ phòng thủ nhưng nhìn chung, sự tấn công của tác nhân gây bệnh không phụ thuộc nhiều vào rào cản này. Thực tế là nhiều tác nhân gây bệnh không thể xâm nhập mặc dù không có trở ngại cấu trúc của ký chủ. Phòng thủ hóa học chắc chắn đóng vai trò quan trọng hơn trong cơ chế phòng thủ bị động của cây. Một số hợp chất hóa học có sẵn và phổ biến bao gồm: Phenolics (phenols, phenolic acids, quinones, flavonoids, flavonones, flavenols, tannins, coumarins); Terpenoids (capsaicin); Alkaloids (berberin, piperine); Lectins và Polypeptides (mannose, fabatin).

§ Các chất ức chế được cây tiết ra bên ngoài: Cây có thể tiết ra một số hợp chất có tính độc đối với nấm bệnh. Ví dụ lá cà chua và củ cải đường tiết ra một số chất kháng nấm, ức chế sự nảy mầm bào tử nấm Botrytis và Cercospora, củ hành tây vỏ trắng bị nhiễm bệnh thán thư (Colletotrichum circinans) còn củ có vỏ đỏ không bị nhiễm do củ vỏ đỏ có khả năng tạo ra các hợp chất phenolics (protocatechuic acid và catechol) có khả năng ức chế sự nảy mầm của nấm. Phun cây hướng dương bằng acibenzola-S-methyl (ASM hay BTH) có thể chống bệnh gỉ sắt (Puccinia helianthi) do ASM có khả năng kích thích cây tiết ra coumarin và các hợp chất phenolics ngăn cản sự nảy mầm và hình thành giác bám của bào tử nấm.

§ Các chất ức chế có sẵn trong tế bào cây: Một số hợp chất như tannin, phenolic và các hợp chất giống acid béo (diene) có sẵn ở nồng độ cao trong tế bào lá non, quả non hoặc hạt có khả năng chống một số loại nấm nào đó, chẳng hạn như Botrytis. Nhiều hợp chất tương tự có khả năng ức chế hoạt động của các enzyme thủy phân, kể cả enzyme phân hủy pectin của tác nhân gây bệnh. Khi mô non trở nên già, nồng độ các chất ức chế này giảm nên tính kháng cũng giảm theo.

§ Catechin (có nhiều trong lá dâu tây) có khả năng ức chế sự hình thành đế xâm nhiễm của bào tử nấm Alternaria alternata. Nhiều hợp chất khác chẳng hạn như saponin (là các hợp chất glycoside của triterpen và steroid; ví dụ điển hình là tomatin trong cà chua) ức chế các nấm thiếu enzyme saponinase phân hủy saponin. Ngoài ra, ở một số cây còn có một số chất, mà có bản chất là các phân tử protein có trọng lượng phân tử thấp gọi là phytocystatin ức chế các enzyme proteinase nhóm cystein có trong hệ tiêu hóa của tuyến trùng và cũng do một số nấm tiết ra. Một nhóm hợp chất nữa gọi là lectin - là các protein liên kết đặc hiệu với đường. Lectin có nhiều trong hạt của nhiều loại cây mà có khả năng dung tan hoặc ức chế sinh trưởng của nhiều loại nấm.

Câu 8: Đặc điểm phòng thủ chủ động nhờ hình thành cấu trúc bảo vệ của cây?

Cây phản ứng lại sự tấn công của tác nhân gây bệnh bằng cách hình thành 4 loại cấu trúc phòng thủ đặc biệt:

            Cấu trúc hình thành lien quan đến tế bào chất của tế bào bị tấn công và được gọi là phản ứng phòng thủ tế bào chất: trong một vài trường hợp đối với các tác nhân ký sinh yếu, chẳng hạn một số chủng nấm Armillaria gây bệnh cây thân gỗ, thì tế bào chất của tế bào ký chủ bao quanh cụm sợi nấm, nhân bị kéo căng và vỡ làm đôi. Trong một số trường hợp, tế bào chất của tế bào ký chủ trở nên đậm đặc và kết hạt, cuối cùng sợi nấm bị phân hủy.

Cấu trúc liên quan đến vách tế bào bị xâm nhập được gọi là: cấu trúc phòng thủ vách tế bào: vách tế bào có thể biến đổi về hình thái để phản ứng lại sự xâm nhiễm của tác nhân gây bệnh, mặc dù kiểu phản ứng này tương đối kém hiệu quả. Trong đó có 4 loại biến đổi chính:

§ Lớp ngoài của vách tế bào nhu mô đang tiếp xúc với vi khuẩn gây bệnh sẽ phồng lên và tạo ra các vật liệu dạng sợi, vô định hình; các vật liệu này sẽ bao quanh và ngăn cản sự nhân lên của vi khuẩn.

§ Vách tế bào hóa dày nhờ một chất có bản chất cellulose; cấu trúc này thường liên kết với các hợp chất phenolic và ngăn cản sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh.

§ Vách tế bào bị lignin hóa nhằm tăng cường khả năng chống lại sự xâm nhập của nấm tạo vòi áp; ngoài ra, sự lignin hóa cũng kháng nước do đó làm giảm hoạt tính của các emzyme phân hủy vách tế bào.

§ Hình thành các núm cấu tạo bởi callose (callose papillae: callose là một polysaccharide thực vật có bản chất là glucose, được hình thành bởi enzyme callose synthetase và bị phân hủy bởi enzyme glucanase). Các núm này hình thành vài phút sau khi tế bào bị tổn thương và khoảng 2-3 giờ sau khi lây nhiễm tác nhân gây bệnh. Mặc dù chức năng chính của núm callose là sữa chữa các tổn thương vách tế bào, thì trong một số trường hợp núm cũng có tác dụng ngăn cản sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh. Trong một số trường hợp các hợp chất callose bao quanh đỉnh sợi nấm xâm nhập, liên kết với các hợp chất phenolic và hình thành một ống bao quanh sợi nấm.

Cấu trúc liên quan đến mô cây phia trước tác nhân gây bệnh (sâu hơn về phía cây) và được gọi là: cấu trúc phòng thủ mô:

§ Hình thành lớp bần (cork layer): Sự xâm nhiễm của nấm, vi khuẩn, một số virus và tuyến trùng thường kích thích sự hình thành các lớp bần phía trước điểm xâm nhiễm. Bần là mô vỏ (thân, rễ) cấu tạo chủ yếu bởi suberin. Các lớp bần ngăn cản tác nhân gây bệnh phát triển xa hơn, đồng thời ngăn cản các độc tố của tác nhân gây bệnh khuếch tán ra phần mô khỏe và ngăn cản sự vận chuyển nước và dinh dưỡng từ phần mô khỏe và phần mô bị nhiễm bệnh. Mô bị chết hoại cùng với tác nhân gây bệnh, bị giới hạn bởi các lớp bần, có thể vẫn ở nguyên vị trí và tạo ra các vết bệnh kiểu vết đốm mà hình dạng, màu sắc và kích thước phụ thuộc vào tổ hợ ký sinh - ký chủ. Đối với một số bệnh, phần mô chết hoại có thể bị mô khỏe phía dưới đẩy lên tạo thành các vết ghẻ hoặc vết vảy, và do đó loại bỏ hoàn toàn tác nhân gây bệnh.

§ Hình thành tầng rời (abscission layer): phiến giữa của hai lớp tế bào bao xung quanh vết bệnh tách khỏi nhau tạo thành một lớp trống gọi là tầng rời. Sự hình thành tầng rời sẽ cô lập phần mô bệnh và thông thường, mô bệnh sẽ tách khỏi mô khỏe tạo ra các lỗ thủng. Sự hình thành tầng rời rất hay bắt gặp trên các lá non đang phát triển của cây quả hạch.

§ Hình thành tylose: Tylose hình thành trong mạch xylem của hầu hết cây bị stress hoặc bị tác nhân gây bệnh hại mạch dẫn tấn công. Tylose là sự sinh trưởng quá mức của protoplasm của tế bào nhu mô bao quanh tế bào xylem và nhô vào trong mạch xylem. Tylose có vách bằng cellulose và do kích thước cũng như số lượng nhiều của nó trong mạch xylem dẫn tới bịt kín mạch xylem ngăn không cho tác nhân gây bệnh phát triển tiếp. Ở một số giống kháng, tylose hình thành rất nhiều và nhanh ngay ohias trước đường tiến của tác nhân gây bệnh trong rễ non và do đó ngăn cản không cho tác nhân gây bệnh phát triển tiếp.

§ Hình thành gôm: Nhiều loại cây, đặc biệt là các cây quả hạch, hình thành gôm ở xung quanh vị trí xâm nhiễm và tạo ra một rào cản không thể vượt qua đối với các tác nhân gây bệnh.

Câu 9: Đặc điểm phòng thủ chủ động sinh hóa của cây?

·    Phytoalexin:

§ Khái niệm: Phytoalexin là các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp, có tính kháng vi sinh vật và được tạo ra bởi cây do hậu quả của sự nhiễm bệnh hoặc các stress sinh học.

§ Đặc điểm: Phytoalexin được tạo ra trên các tế bào khỏe xung quanh, nhằm phản ứng với các chất khuếch tán ra từ các tế bào bị xâm nhiễm hoặc tổn thương. Sự hình thành và tích lũy phytoalexin mang tính cục bộ (có nghĩa phytoalexin không lưu dẫn xa khỏi vị trí xâm nhiễm hoặc tổn thương), và xảy ra khá nhanh (khoảng vài giờ tới tối đa 2 ngày sau lây nhiễm).

§ Các nguồn kích thích hình thành phytoalexin: Các chất kích thích hình thành phytoalexin được gọi là các elicitor. Số lượng và nguồn gốc elicitor rất đa dạng. Nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng (đặc biệt là nấm) là các nhóm tác nhân gây bệnh được biết là tạo ra các elicitor cảm ứng hình thành phytoalexin. Phần lớn các chất elicitor là các hợp chất cao phân tử như các chất cấu tạo vách tế bào nấm (glucan, chitosan, glycoprotein và polysaccharide; các hợp chất này được giải phóng từ vách tế bào nấm nhờ enzyme của tế bào ký chủ). Phần lớn các elicitor là không đặc hiệu (có nghĩa chúng có mặt trên các chủng tác nhân gây bệnh khác nhau và kích thích tạo phytoalexin trên cả giống nhiễm và giống kháng). Mặc dù phần lớn các elicitor có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh thì trong một số trường hợp các hợp chất này lại có nguồn gốc từ tế bào cây. Ví dụ: enzyme galacturonase của tác nhân gây bệnh phân hủy acid galacturonic, một chất cấu tạo nên vách tế bào cây, thành các oligomer có hoạt tính kích thích cây tạo phytoalexin.

§ Phytoalexin hình thành và tích lũy trên mô của cả giống kháng và giống nhiễm. Khi phytoalexin tích lũy tới một nồng độ nào đó sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật (thường là nấm). Các loài/chủng nấm có tính gây bệnh có xu hướng kích thích hình thành phytoalexin với nồng độ thấp hơn so với các loài/chủng không có tính gây bệnh. Ngoài ra, các loài/chủng nấm không có tính gây bệnh cũng dường như kém mẫn cảm với tính độc của phytoalexin hơn so với các loài/chủng nấm có tính gây bệnh..

§ Phytoalexin rất đa dạng về số lượng, cấu trúc. Khoảng 350 chất có tính chất giống phytoalexin đã được phát hiện từ khoảng 30 họ thực vật, trong đó có khoảng 150 chất được phân lập trên cây họ đậu (Leguminosae). Phần lớn phytoalexin được phân lập trên cây hai lá mầm, một số được phân lập trên cây một lá mầm. Cấu trúc hóa học của phytoalexin được phân lập từ một họ cây thường khá giống nhau. Các phytoalexin thuộc nhóm phenylpropanoid phổ biến trong nhiều họ thực vật như Leguminosae, Solanaceae, Convolvulaceae, Umbelliferae và Gramineae; các phytoalexin thuộc nhóm isoflavonoid phổ biến trong họ Leguminosae; các phytoalexin thuộc nhóm sesquiterpenoid phổ biến trong họ Solanaceae.

§ Một số phytoalexin được nghiên cứu nhiều là pisatin (trên đậu Hà Lan), glyceolin (trên đậu tương, cỏ 3 lá, cỏ alfafa), rhisitin (trên khoai tây), capsidiol (trên ớt), cammaxin (trên cây Arabidopsis).

·    Các hợp chất phenolic:

§ Các hợp chất phenolic đơn giản: Một số hợp chất phenolic phổ biến thường hình thành và tích lũy với tốc độ nhanh hơn trên cây bị bệnh, đặc biệt trên các giống kháng. Một số các hợp chất phenolic phổ biến là chlorogenic acid, caffeic acid, ferulic acid. Ví dụ quả đào xanh và quả đào trên giống kháng hình thành nhiều chlorogenic acid khi bị nhiễm nấm Monilinia fructicola. Hợp chất phenolic này ngoài gây độc trực tiếp đối với nấm thì quan trọng hơn còn ức chế các enzyme của nấm dùng để phân hủy mô ký chủ.

§ Các hợp chất phenolic độc hình thành từ các hợp chất phenolic không độc: Nhiều cây chứa các chất glycoside (ví dụ như đường glucose) liên kết với các phân tử phenolic. Ở trạng thái liên kết, các hợp chất này không độc. Một số loại nấm và vi khuẩn có thể hình thành hoặc kích thích mô cây hình thành các enzyme glycosidase thủy phân các hợp chất trên và giải phóng các hợp chất phenolic độc.

§ Vai trò của các enzyme oxy hóa các hợp chất phenolic: Nhiều hợp chất phenol trong cây có độc tính thấp đối với tác nhân gây bệnh. Trong nhiều trường hợp, trong mô nhiễm bệnh của các giống kháng bệnh, hoạt tính của các enzyme oxy hóa phenol (ví dụ polyphenol oxydase) nhìn chung được tăng cường. Các enzyme này sẽ oxy hóa các hợp chất phenolic thành các hợp chất quinone có tính độc mạnh hơn. Một cơ chế khác: Trong quả xanh thường chứa các dien (là các hợp chất hydrocarbon có chứa 2 liên kết kép), có tính độc cao đối với tác nhân gây bệnh. Khi quả chín, lượng lipoxygenase cũng gia tăng dẫn tới các dien bị bẻ gẫy, làm mất tính kháng của quả chín. Ở một số loại quả, elicitor từ nấm không gây bệnh đã kích thích hình thành một hợp chất phenolic gọi là epicatechin. Epicatechin ức chế enzyme lipoxygenase dẫn tới lượng dien không bị giảm và quả chín vẫn có thể kháng được sự xâm nhiễm của nấm (đặc biệt là nấm thán thư - Colletotrichum circinans).

·    PR-protein (pathogenesis related - protein):

§ Định nghĩa: Protein liên quan đến sự gây bệnh (PR protein) là các protein được cây tạo ra do sự gây bệnh bởi các tác nhân gây bệnh chủ yếu thuộc nhóm nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng. Ngoài ra, sự tấn công của côn trùng (đặc biệt là nhóm chích hút) cũng kích thích cây tạo ra PR protein. Hiện có khoảng 17 nhóm (còn được gọi là các họ) PR protein khác nhau, được ký hiệu từ PR1 đến PR 17 (theo thứ tự được phát hiện. Nhiều nhóm có hoạt tính kháng nấm.

§ PR-1: Là nhóm protein có số lượng nhiều nhất, thường hình thành trong cây với hàm lượng rất cao sau khi bị nhiễm bệnh (có thể đạt tới 1-2% tổng lượng protein lá). Protein của nhóm này đã được phát hiện thấy trên tất cả các loại cây được kiểm tra. Các protein chức năng tương tự PR-1 cũng được phát hiện thấy ở nhiều sinh vật khác như nấm, côn trùng, động vật có xương sống (kể cả người). Mặc dù chức năng sinh học và cơ chế hoạt động của nhóm này chưa rõ nhưng các PR-1 có hoạt tính kháng nấm cả invitro và invivo. Các protein PR-1 có thể chỉa thành 2 nhóm hoặc kiềm hoặc acid. Trên thuốc lá, có ít nhất 16 protein PR-1 đã được khám phá, trong đó có 3 protein loại acid (PR-1a, PR-1b, PR-1c) và 1 protein kiềm (PR-1g) hình thành khi cây bị nhiễm virus khảm thuốc lá Tobacco mosaic virus. Trên lúa có 23 gen mã hóa protein PR-1. Trên ớt, sự biểu hiện của gen PR-1 loại kiềm được cảm ứng bởi TMV đã tạo tính kháng đối với Phytophthora parasitica var nicotianae, Ralstonia solanacearum, và Pseudomonas syringae pv tabaci.

§ PR-2: (b-1.3-glucanase) là nhóm protein có mặt trong nhiều loại cây, động vật và vi sinh vật. Glucanase có thể chia thành 3 nhóm: nhóm I là các glucanase có tính kiềm hình thành ở không bào; nhóm II và III có tính acid và là các protein ngoại bào. Glucanase thuộc nhóm I có hoạt tính kháng nấm cả invitro và invivo. Glucanase thuộc nhóm II và III chỉ có hoạt tính kháng nấm nếu phối hợp với glucanase nhóm I hoặc chitinase. Đặc tính kháng nấm của glucanase là khả năng phân hủy vách tế bào của nấm (cấu tạo bởi glucan).

§ PR-3 (chitinase lớp I, II, IV, VI, VII), PR-8 (chitinase lớp III) và PR-11 (chitinase lớp V). Các chitinase là loại protein chiếm số lượng lớn thứ 2 trong các PR protein. Các chitinase thực vật được chia làm 7 lớp (I, II....VI) căn cứ vào cấu trúc protein, tính đặc hiệu cơ chất, cơ chế xúc tác và tính mẫn cảm với các chất ức chế. 7 lớp này lại được xếp vào 3 nhóm PR protein. Các chitinase có hoạt tính kháng nấm bằng cách xúc tác cho phản ứng thủy phân để cắt liên kết β-1,4-glycoside của N-acetyl-D-glucosamine (chitin, thành phần của vách tế bào nấm). Cần chú ý là phản ứng thủy phân này tạo ra các oligosaccharide có vai trò là elicitor cho các phản ứng phòng thủ khác.

§ PR-4 (protein liên kết chitin). Hoạt tính kháng nấm của các protein nhóm PR-4 là do khả năng liên kết với chitin của vách tế bào nấm dẫn tới ức chế sinh trưởng của nấm. Loại PR-4 phổ biến nhất là legumin và vicilin (chiếm tới 80% hàm lượng protein của hạt đậu). Vicilin đã được chứng minh có khả năng ức chế sinh trưởng và nảy mầm bào tử của nhiều loại nấm như Fusarium solani, F. oxysporum, Collectotrichum musae, Phytophthora capsici, Neurospora crassa, Ustilago maydis. Vicilin cũng được biết là có khả năng kháng cả côn trùng như một đậu (Callosobruchus maculatus).

§ PR-5 (Thaumatin-like proteins). Osmotin và thaumatin-like (TL) protein là các protein có tính kiềm và có mức tương đồng chuỗi aa đáng kể với thaumatin (một protein có vị ngọt, phân lập từ cây Thaumatococcus danielli. Osmotin và TL tương tác với màng tế bào nấm và hình thành các lỗ thủng xuyên màng. Hai loại protein này cũng có hoạt tính 1,3-glucanase, liên kết với actin. Osmotin trên thuốc lá kích thích MAPK do đó phá vỡ 1 đường hướng dẫn truyền tín hiệu (dựa vào MAPK) nhằm tăng cường tính ổn định của vách tế bào nấm. TL protein có mặt trong nhiều loài cây.

§ PR-6. Là họ các protein ức chế protease. Các protein PR6 có thể ức chế các protease nhóm aspartic, serine, cystein.

§ PR-12 (Defensins) và PR-13 (thionins). Defensin và thionin là các protein có trọng lượng phân tử nhỏ (~5 kD), kích thước khoảng 45-54 aa. Các protein này là các protein hoạt động trên màng, phát hiện thấy ở tất cả các nhóm sinh vật và độc đối với nấm. Cơ chế gây độc đối với nấm của các loại protein này vẫn chưa rõ nhưng defensin đã được chứng tỏ là làm tăng vận chuyển ion K+ ra ngoài màng, tăng hấp thụ Ca+2 của nấm Neurospora crassa. Chất defensin Dm-AMP1 của cây thược dược có thể tương tác đặc hiệu với sphingolipid của nấm men Sacharomyces cerevisiae.

§ PR-14 (Protein vận chuyển lipid-LTP). Các LTP là các protein nhỏ, có tính kiềm. LTP vận chuyển phospholipid qua màng. Phân tử LTP có cấu hình gồm một xoang ghét nước chạy dọc phân tử. Phân tử LTP khi tương tác với màng tế bào nấm sẽ tự gắn xuyên qua màng tế bào và xoang ghét nước sẽ tạo ra các lỗ dò trên màng tế bào nấm và nấm sẽ chết. Ngoài ra, một LTP từ cây Arabidopsis đã được chứng minh có khả năng vận chuyển các các phân tử tín hiệu trong phản ứng SAR.

Câu 10 : Khái niệm sự chết tế bào được lập trình (PCD), apoptosis và phản ứng siêu nhạy (HR).?

·   Sự chết tế bào được lập trình (PCD)

PCD là quá trình tự chết của tế bào, có những biến đổi hình thái đặc trưng, diễn ra theo một trình tự nhất định, được điều khiển bởi di truyền, nhằm đạt được và duy trì trạng thái cân bằng trong quá trình phát triển và chống lại các street môi trường và sự tấn công của tác nhân gây bệnh.

PCD xuất hiện thường xuyên trong suốt đời sống thực vật, trong quá trình biệt hóa cơ quan, mô và tế bào. Các ví dụ là:

Sự hình thành và phát triển hoa: hoa đực hình thành do PCD ở các tế bào vòi nhụy, noãn hình thành trước đó; và ngược lại, hoa cái hình thành do PCD ở các tế bào nhị đực.

Các tế bào chóp rễ bị chết do PCD trong quá trình phát triển; hoặc các rễ bên hình thành mới tại vị trí có dinh dưỡng hoặc nước còn các rễ già không chức năng sẽ chết do PCD.

          Tầng aleuron sẽ chết do PCD sau khi phôi phát triển.

Hai dạng chính của PCD là tự thực bào (autophagy) và apoptosis. Ngoài ra, nhằm chống lại sự tấn công của tác nhân gây bệnh, thực vật còn phát triển một loại PCD nữa là phản ứng siêu nhạy (Hypersensitive Resopnse - HR).

·  Apoptosis

Apoptosis là một dạng PCD và hiện đang nhận được nhiều chú ý trong nghiên cứu y sinh và cả tính kháng bệnh ở thực vật. Apoptosis là một quá trình chết sinh lý nhằm loại bỏ có chọn lọc các tế bào không mong muốn. Quá trình apoptosis có một số đặc điểm sau: tế bào chất bị nhăn, màng tế bào chất bị phồng, mất tiếp xúc giữa các tế bào, nDNA (DNA nhân) bị phân cắt tại các vị trí bên trong nhiễm sắc thể, tăng cường luồng ion Ca vào tế bào, hoạt hóa một số enzyme đặc biệt và giải phóng cytochrome c khỏi ty thể. Ngoài ra apoptosis liên quan đến đường hướng dẫn truyền tín hiệu dựa vào ceramide (là một họ các phân tử chất béo; một ceramide gồm một phân tử sphingosin và một phân tử acid béo). Các ceramide là các phân tử gắn trên màng.

Người ta đã phát hiện thấy một số độc tố nấm như fumonisinB (do nấm Fusarium moniliforme) và AAL toxin (do nấm Alternaria alternate) có khả năng ức chế các enzyme ceramidase dẫn tới hoạt hóa phản ứng apoptosis.

·  Phản ứng siêu nhạy - HR

Một trong các dấu hiệu của tính kháng bệnh là phản ứng siêu nhạy. Phản ứng siêu nhạy (HR) được định nghĩa là sự chết nhanh chóng và cục bộ của tế bào thực vật tại vị trí nhiễm bệnh.

HR có thể được cảm ứng bởi nhiều nhóm tác nhân gây bệnh (nấm sinh dưỡng, vi khuẩn, virus và tuyến trùng). HR thường xuất hiện trong nhiều tính kháng: tính kháng phi kí chủ/kí chủ, tính kháng thông qua gen R, tính kháng đơn gen/đa gen...

HR là hậu quả của một dòng thác các phản ứng dẫn truyền tín hiệu và phòng thủ tại các tế bào bị xâm nhiễm hoặc lân cận dẫn tới hình thành các chất độc (ví dụ các hợp chất phenolic bị oxy hóa) đầu độc cả tế bào lẫn tác nhân gây bệnh. Ngoài ra, nếu tác nhân gây bệnh không chết thì mô bị chết hoại cũng ngăn không cho tác nhân gây bệnh lan truyền tiếp. Cần chú ý là, trong nhiều trường hợp, HR không hình thành vết chết hoại có thể nhìn thấy bằng mắt thường vì HR xuất hiện chỉ ở tế bào nhiễm bệnh hoặc ở vài tế bào xung quanh.

HR của tế bào ký chủ có một số đặc điểm khá khác biệt so với các dạng PCD khác, nhất là về biến đổi hình thái của tế bào ký chủ. Nghiên cứu phản ứng siêu nhạy giữa nấm Uromyces vignae và đậu đũa, giữa nấm Erysiphe graminis f.sp hordei và tiểu mạch thấy các sự kiện sau: (1) nhân tế bào ký chủ di chuyển tới vị trí xâm nhiễm, dòng tế bào chất mất linh động, trở nên căng; (ii) tế bào chất ngừng chuyển động, các cơ quan tử chuyển động Brown, nhân hóa đậm đặc, tích lũy các thể hạt ở ngoại vi tế bào chất, nguyên sinh chất trở nên nhăn; và (iii) tế bào chất sụp đổ, tế bào chết. Các nghiên cứu gần đây còn cho thấy trong phản ứng HR, các loại màng bị mất chức năng, tế bào chất hóa không bào mạnh (vacuonization), phá hủy không bào và hình thái ty thể bị biến đổi toàn diện (ty thể bị phồng lên và rãnh ty thể bị phá hủy). Ngoài ra một đặc điểm để phân biệt khác là tốc độ phản ứng. Nhìn chung, HR diễn ra rất nhanh: khi nghiên cứu tổ hợp nấm Phytophthora infesstans/ khoai tây và sử dụng kính hiển vi video, người ta đã quan sát thấy tế bào ký chủ sụp đổ và chết sau 26 giây và nấm chết sau đó khoảng 20 giây; vết chết hoại có thể quan sát thấy bằng mắt sau nhiều giờ (ví dụ sau 8-12 giờ sau khi lây nhiễm vi khuẩn Erwinia carotovora mang gen HrpEcc trên thuốc lá).

Việc phân biệt HR và các dạng PCD khác không dễ dàng. Trong một số trường hợp, HR có biểu hiện biến đổi hình thái giống như apoptosis chẳng hạn như: khi nhiễm nấm gỉ sắt Uromyces vignae trên giống đậu đũa kháng bênh đã tạo ra phản ứng HR, trong đó nDNA của các tế bào chết hoại đã bị phân cắt thành thang DNA, một dấu hiệu của apoptosis. Hơn nữa các đường hướng nhận biết, dẫn truyền tín hiệu và các đặc trưng sinh hóa khá giống nhau giữa HR và apoptosis, chẳng hạn đều có sự liên quan đến dòng thác ion (Ca+2, K+1) vào/ra tế bào, các lớp oxy hoạt hóa (O2-, H2O2), nitơ hoạt hóa (NO), các protein kinase...

Câu 11: Khái niệm và đặc điểm quan hệ gen-đối-gen?

·  Khái niệm

Thực tế, Flor chưa bao giờ đưa ra một định nghĩa rõ ràng về lý thuyết của mình. Năm 1971, tổng kết nghiên cứu của mình và của các tác giả khác, Flor đã viết" đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây ký chủ có một gen tương ứng qui định tính gây bệnh trong ký sinh "For each gene that conditions resistance in the host there is a corresponding gene that conditions pathogenicity in the parasite". Khẳng định này của Flor được sử dụng rộng rãi và được xem là định nghĩa chính thức của Flor về thuyết gen-for-gen.

Vì mối quan hệ gen-đối-gen thường là quan hệ trội-trội trong khi đó "gen qui định tính gây bệnh" thường được hiểu là gen lặn nên định nghĩa trên của Flor dễ gây nhầm lẫn. Do vậy, khái niệm gen-đối-gen của Flor đã được biến đổi một chút cho phù hợp với lý thuyết của ông như sau: "đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây ký chủ có một gen tương ứng qui định tính không độc trong ký sinh và 2 gen này tương tác đặc hiệu với nhau"; "for each gen determining resistance in the host there is a corresponding gen for avirulence in parasite with which it specifically interacts".

Quan hệ gen-đối-gen cho tới nay đã được chứng minh là tồn tại trong rất nhiều loại bệnh do hầu hết các nhóm tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng, mollicute...) gây ra.

Các gen cây ký chủ qui định tính kháng (chú ý không nhất thiết phải tuân theo quan hệ gene-for-gene) được gọi chung là gen R (Resistance). Các gen ký sinh qui định tính không độc của ký sinh được gọi chung là gen Avr (Avirulence). Các ký hiệu R hoặc Avr sẽ được viết thường là r hoặc avr nếu trạng thái của gen là lặn. Các chữ số viết kèm theo (nếu có) cho biết sự tương ứng của các cặp gen. Ngoài qui định chung này, trên mỗi hệ ký sinh-ký chủ, người ta thường sử dụng các ký hiệu riêng. Ví dụ:

            Cây lanh: L2, L5                         <=>     Nấm M. lini: AL2 (hoặc AvrL2), L5 (hoặc AvrL5)

            Cây lúa: Pi-ta                  <=>     Nấm P. oryzae : AvrPi-ta

            Cây lúa: Xa5, Xa21         <=>     Vi khuẩn X. oryzae: AvrXa5, AvrXa21

            Cây cà chua: Cf2, Cf9    <=>     Nấm C. fulvum: Avr2, Avr9

            Cà chua: AvrPto                         <=>     Vi khuẩn P. syringae: Pto

·  Đặc điểm quan hệ gen-đối-gen

          Phần lớn quan hệ gen-đối-gen là quan hệ trội-trội có nghĩa đối với cây ký chủ, gen qui định tính kháng là gen trội (R) còn gen qui định tính mẫn cảm (thiếu tính kháng) là gen lặn (r); đối với ký sinh, gen qui định tính không độc (không có khả năng gây bệnh) là gen trội (Avr) còn gen qui định tính độc là gen lặn (avr). Nói cách khác cả gen kháng của ký chủ và gen không độc của ký sinh đều phải được biểu hiện để tạo ra tính kháng.

          Mỗi gen ký chủ thường nhận biết và tương tác với chỉ gen tương ứng của ký sinh (và ngược lại). Điều này dẫn tới nếu ký chủ có nhiều gen kháng/nhiễm và ký sinh có nhiều gen không độc/độc thì tính kháng chỉ có thể hình thành khi ít nhất có tương tác của một cặp gen tương ứng. Ví dụ:

            Cây (R1, r2, r3) + ký sinh (Avr1, Avr2, Avr3) => kháng

            Cây (R1, r2, r3) + ký sinh (avr1, Avr2, Avr3) => nhiễm

          Số lượng chủng (race) tối đa trong quần thể tác nhân gây bệnh =2n trong đó n là số gen kháng R trong quần thể ký chủ.

          Việc xác định kiểu hình kháng hay nhiễm hoàn toàn dễ dàng khi sử dụng bảng punnett. Khi xây dựng bảng punnett cần chú ý là kiểu gen của cây ký chủ là lưỡng bội còn kiểu gen của ký sinh sẽ hoặc đơn bội hoặc lưỡng bội tùy thuộc loại tác nhân gây bệnh. Ví dụ ký sinh có kiểu gen đơn bội là vi khuẩn, nhiều loại nấm túi (như nấm đạo ôn lúa Pyricularia oryzae); ký sinh có kiểu gen lưỡng bội là tuyến trùng, các loài nấm đảm (như nấm gỉ sắt, than đen...).

          Tính kháng của cây trồng tuân theo quan hệ gen-đối-gen được gọi là tính kháng gen-đối-gen. Tính kháng gen-đối-gen thường là tính kháng đặc hiệu ký chủ, tính kháng đơn gen, tính kháng gen chủ, tính kháng không bền vững.

          Hậu quả của một phản ứng kháng gen-đối-gen thường là phản ứng siêu nhạy/apoptosis.

Câu 12: Đặc điểm Avr gen (Avr protein). Đặc điểm họ gen AvrBs3 của vi khuẩn Xanthomonas. Đặc điểm các Avr gen của nấm và virus.?

Sự tồn tại của các gen Avr và sản phẩm của chúng là các protein Avr đã được chứng minh bằng thực nghiệm dựa trên các thí nghiệm của Flor từ những năm 1940. Cho tới nay, nhiều gen Avr đã được xác định từ nhiều nhóm tác nhân gây bệnh bao gồm nấm, vi khuẩn và virus.

Một số thuật ngữ liên quan hiện đang được sử dụng:

Effector (chất hiệu ứng): là phân tử có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh tác động lên tế bào ký chủ, nhờ đó tạo điều kiện cho sự nhiễm bệnh. Một effector được gọi là elicitor khi nó bị cây nhận biết và khởi động phản ứng phòng thủ.

Elicitor (chất kích hoạt): là phân tử có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh khởi động phản ứng phòng thủ dẫn tới tăng cường tính kháng và được cây nhận biết. Khi sự nhận biết được thực hiện nhờ protein R của cây ký chủ thì elicitor của tác nhân gây bệnh được xem là protein Avr.

Định nghĩa gen Avr

Gen Avr là các gen làm cho tác nhân gây bệnh trở thành không độc khi có mặt gen kháng R của cây ký chủ. Khả năng này của gen Avr có được là do sản phẩm protein của nó cảnh báo tế bào cây ký chủ về sự tấn công của tác nhân gây bệnh và do đó khởi động phản ứng phòng thủ dẫn tới phản ứng siêu nhạy/apoptosis. Như vậy có thể xem protein Avr là elicitor được cây nhận biết thông qua gen kháng R.

Không giống như gen/protein kháng R của cây, nhìn chung, gen/protein Avr của tác nhân gây bệnh chia sẻ ít đặc điểm chung với nhau. Dưới đây là một số đại diện gen/protein Avr.

Họ gen AvrBs3 của vi khuẩn Xanthomonas. Cho tới nay, khoảng 40 gen Avr thuộc họ này đã được xác định từ nhiều loài vi khuẩn Xanthomonas kể cả 1 gen Brg11 của vi khuẩn Ralstonia solanacearum. Các ví dụ về các gen Avr thuộc họ này bao gồm:

X. campestris pv. vesicatoria

AvrBs3, AvrBs4

X. oryzae pv. oryzae

AvrXa5, AvrXa3, AvrXa7, AvrXa10, AvrXa27

X. oryzae pv. oryzicola

Avr/pth3, Avr/pth13, Avr/pth14

X. campestris pv. malvacearum

AvrP6, PthN

X. axonopodis pv. citri

Apl1, Apl2, Apl3, PthA, PthA1, PthA2, PthA3, PthA4, PthB

X. campestris pv. manihotis

PthB

Ralstonia solanacearum

Brg11

Các gen thuộc họ này mã hóa cho các protein chứa khoảng 13 - 23 các chuỗi lặp gồm 34 aa ở vùng trung tâm. Đầu C của các protein này chứa dấu hiệu nhập nhân (Nuclear Localization Signal - NLS) và một vùng hoạt hóa phiên mã (Activated Domain - AD). Cấu trúc này chứng tỏ (đã được chứng minh bằng thực nghiệm) các protein này hoạt động trong nhân và tương tác với quá trình phiên mã của tế bào ký chủ.

Gen AvrPto của vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. tomato (gây bệnh đốm đen vi khuẩn cà chua). Gen này mã hóa protein AvrPto có trọng lượng phân tử thấp khoảng 18 kD và được hệ thống tiết loại 3 của vi khuẩn đưa và trong tế bào chất.

Các gen Avr của nấm. Có khá nhiều gen Avr của nấm đã được phân lập. Một số protein Avr là các protein giàu cystein như AvrCf2 của nấm Cladosporium fulvum; AvrP4; AvrP123 của nấm M. lini. Một số protein Avr được nấm tiết ra ở gian bào (apoplasm) và tương tác với protein R của ký chủ ở bề mặt tế bào; vi dụ như các protein AvrCf2, vrCf4, AvrCf9 của nấm C. fulvum. Một số lại được nấm tiết trực tiếp vào tế bào chất qua vòi hút chẳng hạn như các protein kháng của nấm sương mai, phấn trắng, gỉ sắt.

Các gen Avr của virus. Đối với virus thực vật, các gen Avr thường liên quan đến 1 protein chức năng của virus. Ví dụ điển hình là protein tái sinh (Replication protein) của Tobacco mosaic virus - TMV. Gen Rep của TMV là gen không độc tương ứng với gen kháng N trong cây thuốc lá. Ngoài ra, các protein vỏ (Coat Protein-CP) của virus cũng là gen Avr phổ biến đối với virus.

Một câu hỏi cần đặt ra là tại sao các gen/protein Avr của tác nhân gây bệnh làm giảm khả năng tấn công (mất ưu thế thích nghi) của tác nhân gây bệnh lại vẫn tồn tại trong quần thể tác nhân gây bệnh. Câu trả lời là mặc dù các gen này có thể tương tác (trực tiếp hoặc gián tiếp) với gen kháng thì trong trường hợp không có gen kháng, các gen Avr này vẫn có một số chức năng có lợi cho tác nhân gây bệnh. Ví dụ trên cây cà chua thiếu gen kháng Pto thì gen AvrPto sẽ tạo điều kiện cho sự gây bệnh của vi khuẩn bằng cách ức chế sự phòng thủ vách tế bào cây (thí nghiệm trên cây Arabidopsis). Các nghiên cứu đối với nấm Phytophthora infestans, Puccinia graminis cho thấy, ngay sau khi áp lực chọn lọc bởi gen kháng R của ký chủ bị mất thì các gen Avr tái xuất hiện.

Câu 13: Phân loại 5 lớp gen kháng R (protein R); lấy ví dụ mỗi loại.?

Như đã biết, nhiều loại tác nhân gây bệnh có thể tiếp xúc với cây nhưng nhìn chung cây có thể kháng lại tốt với phần lớn tác nhân gây bệnh. Thậm chí tác nhân có thể tấn công và gây bệnh thì cây vẫn có thể biểu hiện tính kháng với các mức độ khác nhau. Cho tới nay, rất nhiều gen kháng R của cây đã được xác định. Các gen kháng này có thể qui định tính kháng thông qua quan hệ gen-đối-gen hoặc không. Sản phẩm của các gen này gọi là các protein kháng R

Phân loại protein kháng R. Hiện nay, các protein kháng R được chia thành 5 lớp dựa trên đặc điểm cấu trúc và vị trí hoạt động của chúng trong tế bào ký chủ. Các protein trong cùng lớp nhìn chung khá bảo thủ.

1.1.  Pto

Lớp protein thứ nhất chỉ gồm 1 thành viên là Pto phân lập từ cà chua. Pto có 1 vùng có hoạt tính xúc tác kinase. Pto là gen kháng hoạt động trong tế bào chất. Pto là protein kháng chống vi khuẩn P. syringae pv. tomato mang gen AvrPto. Pto có hoạt tính kinase điều khiển dẫn truyền tín hiệu trong tế bào chất dẫn tới phản ứng siêu nhạy.

1.2.  CNL (CC-NB-LRR)

Lớp protein kháng thứ hai gồm một số lượng lớn protein có cấu trúc gồm (1) một vùng khóa kéo leucine (leucine-zipper - LZ) hoặc một chuỗi xoắn kép (coiled-coil - CC) ở đầu amin; (2) một vùng có khả năng liên kết nucleotide (nucleotide binding - NB) ở vùng trung tâm; và (3) một vùng lặp giàu leucine (leucine-rich repeats - LRR) phía đầu carboxyl. Các protein của lớp này hoạt động trong tế bào chất. Các ví dụ về protein lớp CNL trình bày ở Bảng 2.

1.3.  TNL (TIR-NB-LRR)

Lớp protein kháng thứ ba là lớp có số lượng lớn nhất và chỉ có ở cây 2 lá mầm. Về cấu trúc, lớp protein TNL tương tự lớp CNL nhưng thay vì chuỗi CC là một chuỗi TIR. Chuỗi TIR là một vùng protein tương đồng với receptor Toll (của ruồi dấm) và receptor Interleukin-1 (của người) (TIR = Toll/Interleukin-1 Receptor). Tương tự protein kháng lớp CNL, các protein của lớp TNL cũng hoạt động trong tế bào chất. Các ví dụ về protein lớp TNL trình bày ở Bảng 2.

Cả 2 lớp CNL và TNL còn được xếp vào chung một họ protein kháng gọi là họ NB-LRR. Số lượng gen kháng của họ này đươc xem là chiếm số lượng lớn nhất trong các họ protein (Ví dụ trên lúa có hơn 400 gen; Arabidopsis có 150 gen).

Đối với cả 2 lớp, đầu amin (chứa vùng CC hoặc TIR) chịu trách nhiệm tương tác với phân tử được bảo vệ - guardee (xem phần 1.5) hoặc với các phân tử phía hạ lưu của đường hướng dẫn truyền tính kháng. Phần trung tâm là vùng NBS có khả năng liên kết và thủy phân ATP và do đó chịu trách nhiệm khởi động đường hướng dẫn truyền tín hiệu. Ở đầu carboxyl, chuỗi LRR chịu trách nhiệm qui định tính đặc hiệu đối với elicitor mặc dù phần lớn là gián tiếp.

1.4.  Cf

Lớp protein kháng thứ tư là một số các protein Cf phân lập từ cà chua như Cf2, Cf4, Cf5, Cf9 qui định tính kháng với nấm Cladosporium fulvum mang các gen Avr tương ứng là AvrCf2, AvrCf4, AvrCf5, AvrCf9. Các protein này thiếu vùng NB; không có hoạt tính kinase. Các prtein nhóm này là các protein xuyên màng với vùng LRR nằm bên ngoài (trên bề mặt tế bào).

1.5.  Xa21

Lớp protein kháng thứ 5 chỉ có protein Xa21 phân lập từ lúa. Protein Xa21 là một protein xuyên màng, có một vùng LRR  nằm bên ngoài (trên bề mặt tế bào) và một vùng kinase nằm bên trong tế bào chất.

Một số protein R không thuộc 5 lớp trên gồm:

          Hml là một enzyme khử độc và kháng nấm Cochlibolus trên ngô.

          Mlo là một protein màng tế bào lúa miến (barley) mà các đột biến lặn của nó qui định tính kháng nấm phấn trắng và có lẽ điều khiển âm các phản ứng phòng thủ.

          RPW8 là protein phân lập từ cây Arabidopsis qui định tính kháng nấm phấn trắng theo kiểu không đặc hiệu chủng. PRW8 cũng là một protein xuyên màng.

Câu 14: Hai loại tương tác của Avr và  R protein (lấy 1 ví dụ mỗi loại)?

·   Tương tác trực tiếp - mô hình Elicitor - Receptor

Quan hệ gen-đối-gen lúc đầu đã được giả thiết là dựa trên tương tác trực tiếp giữa protein R và Avr protein. Sự tương tác này được gọi là mô hình Elicitor - Receptor, trong đó elicitor là các protein Avr đóng vai trò là chất kích hoạt còn receptor các protein kháng đóng vai trò là chất tiếp nhận. Phản ứng kháng hình thành chỉ khi có sự tương tác trực tiếp giữa elicitor và receptor. Hiện nay, sự tương tác trực tiếp giữa 2 thành phần này mới chỉ được chứng minh là đúng trên một số ít trường hợp, tất cả đều liên quan đến các protein kháng lớp TIR/CC-NBS-LRR. Dưới đây là các trường hợp có tương tác trực tiếp.

            Tương tác giữa protein AvrPi-ta (của nấm Pyricularia oryzae) và protein Pi-ta (lúa).

Lúa      ó   Nấm Pyricularia oryzae

Pi-ta     ó              AVR-Pita          

            Tương tác giữa AvrL567 (của nấm M. lini) và các protein L5, L6, L7 (họ các protein kháng thuộc locus L của cây lanh).

            Tương tác giữa AvrPopP2 (của vi khuẩn R. solanacearum) và protein RRS1 (của Arabidopsis).

            Tương tác trực tiếp giữa: FLS2 (của cây) và Fgl22 (của lông roi vi khuẩn Gram -).

Mô hình tương tác trực tiếp không thể giải thích được tại sao chỉ với một số gen kháng, cây trồng có thể nhận biết được một số lượng lớn các effector của tác nhân gây bệnh.

·   Tương tác gián tiếp - mô hình bảo vệ (Guard model)

Sự tương tác giữa gen kháng R và Avr để dẫn tới phản ứng kháng gần đây đã được chứng minh chủ yếu thực hiện theo cách gián tiếp gọi là "mô hình bảo vệ". Theo mô hình này, protein kháng R của ký chủ sẽ liên kết và "bảo vệ" một protein A. Protein được bảo vệ (guardee) này sẽ tương tác với protein Avr của tác nhân gây bệnh và hoạt hóa protein R dẫn tới kích hoạt các phản ứng dẫn tới tính kháng. Thực sự protein kháng R của cây không phát hiện protein Avr mà phát hiện hoạt động của nó có nghĩa nếu protein Avr khi có mặt trong tế bào mà không hoạt động tức không tương tác, thường thông qua hoạt tính enzyme của nó đối với phân tử được bảo vệ, thì protein kháng R sẽ không phát hiện.

Mô hình bảo vệ giải thích được tại sao chỉ với một số gen kháng, cây trồng có thể nhận biết được một số lượng lớn các effector của tác nhân gây bệnh. Mô hình này đã được chứng minh bằng thực nghiệm trên nhiều trường hợp. Dưới đây là một số ví dụ:

            AvrPphB của vi khuẩn P. syringae và protein kháng RPS5 của cây Arabidopsis. AvrPphB là một protease nhóm cystein. Sau khi được vi khuẩn đưa vào trong tế bào cây, AvrPphB sẽ cắt một phân tử protein kinase của ký chủ là PBS1. Protein kháng RPS5 sẽ nhận biết được việc cắt này và khởi động phản ứng kháng.

            AvrRpm1 (hoặc AvrB) của vi khuẩn P. syringae và protein kháng RPM1 của cây Arabidopsis. Khi được đưa vào trong tế bào, AvrRpm1 (hoặc AvrB) sẽ  phosphoryl hóa một protein của ký chủ là RIN4. Protein kháng RPM1 giám sát hiện trạng của RIN4 và do đó nhận biết sự phosphoryl hóa của RIN4 và khởi động phản ứng phòng thủ.

Arabidopsis      ó      Pseudomonas syringae

      RPM1 / RIN4    ó              AVR-Rpm1

Gen kháng   Guardee

Câu 15: Liệt kê cơ chế tạo tính đa dạng của nấm, vi khuẩn và virus. Các lực chính điều khiển sự tiến hóa của tác nhân gây bệnh (rào cản địa lý và cây ký chủ)?

· Cơ chế tạo tính đa dạng của nấm:

            Nấm - Sinh sản hữu tính

Nấm và vi sinh vật giống nấm gây bệnh cây được phân loại thành các ngành (Division) khác nhau trên cơ sở sinh sản hữu tính, ví dụ Ngành Nấm Trứng (Oomycota) (ví dụ như Phytophthora) sinh sản hữu tính tạo bào tử trứng (oospore); Ngành Nấm Đảm (Basidiomycota) (ví dụ như các loại nấm gỉ sắt) sinh sản hữu tính tạo bào tử đảm (basidiospore); Ngành Nấm Túi (Ascomycota) (ví dụ như nấm đạo ôn lúa Magnaporthe oryzae) sinh sản hữu tính tạo bào tử túi (ascospore).

Trong quá trình sinh sản hữu tính, nấm có thể trao đổi vật liệu di truyền thông qua tái tổ hợp dẫn tới kiểu hình (kể cả các tính trạng kháng bệnh) của con cháu khác với bố mẹ.

Nấm sinh sản hữu tính nhờ sự tương hợp hữu tính (sexual compatibility) và được điều khiển bởi các gen qui định kiểu ghép cặp (mating type) khác nhau. Nếu sự sinh sản hữu tính được thực hiện từ 2 cá thể khác nhau thì nấm được gọi là loài dị tản (heterothallic). Ví dụ nấm Phytophthora infestans là một loài dị tản, có 2 kiểu ghép cặp ký hiệu là A1 và A2. Chỉ khi 2 mẫu nấm P. infestans độc lập (dị tản) có kiểu ghép cặp khác nhau mới có thể sinh sản hữu tính. Nếu sự sinh sản hữu tính được thực hiện từ cùng một cá thể (tự thụ) thì nấm được gọi là loài đồng tản (homothallic). Chú ý sinh sản hữu tính đồng tản không được điều khiển bởi gen qui định kiểu ghép cặp và cũng không tạo ra sự đa dạng di truyền.

 Sự giao phối chéo (intersterility) khác loài chỉ xảy ra đối với nấm đảm và cũng chỉ xảy ra giữa các loài khá đồng nhất về di truyền. Sinh sản cận tính (parasexuality), thường được định nghĩa chính thức là một hình thức sinh sản hữu tính trong loài,  nhưng cũng có thể xảy ra giữa các loài có quan hệ gần gũi như đã được chứng minh đối với một số loài nấm trứng như Phytophthora. Chú ý trong sinh sản cận tính khác loài, có sự trao đổi và tái tổ hợp vật liệu di truyền nhưng không có phân bào giảm nhiễm (meiosis). Nhiều loài nấm Phytophthora thường phát hiện thấy cùng gây bệnh trên một cây và việc giao phối cận tính có thể xảy ra, nhưng con lai thường bất dục. vi dụ chỉ khoảng 4-5% con lai giữa P. palmivora và  P. cinnamomi có khả năng sinh bào tử trứng.

Sư trao đổi vật liệu di truyền thông qua sinh sản có nghĩa từ thế hệ bố mẹ sang thế hệ con cháu được gọi là chuyển gen theo chiều dọc (vertical gene transfer).

            Nấm - chuyển gen theo chiều ngang

Cho tới nay, nhiều bằng chứng cho thấy nấm có khả năng chuyển vật liệu di truyền không thông qua sinh sản giữa các cá thể trong loài và khác loài. Sự di chuyển vật liệu di truyền theo kiểu này được gọi là chuyển gen theo chiều ngang (horizontal gene transfer). Sự chuyển gen theo chiều ngang có thể thực hiện thông qua plasmid (vd plasmid của nấm Neurospora; chú ý plasmid của nấm thường là dạng sợi thẳng, kích thước khoảng 2-10 kb); virus (ví dụ virus của nấm Rhizoctonia solani)...

            Nấm - Đột biến.

Đối với nấm, ngoại trừ nấm đảm, thì giai đoạn vô tính và sinh sản vô tính chiếm ưu thế trong chu kỳ phát triển. Nhiều loài thậm chí giai đoạn hữu tính không xảy ra trong tự nhiên (ví dụ như đối với nấm đạo ôn lúa Magnaporthe oryzae). Như vậy đột biến là một cơ chế quan trọng dẫn tới sự đa dạng của nấm.

· Các lực chính điều khiển sự tiến hóa của tác nhân gây bệnh:

Trong di truyền quần thể, nhìn chung, người ta xét 5 lực tiến hóa có ảnh hưởng tới cấu trúc di truyền của quần thể tác nhân gây bệnh. Các lực này là: đột biến, trôi dạt di truyền, dòng gen, hệ thống ghép cặp và chọn lọc tự nhiên. Chúng ta xét 2 yếu tố quan trọng liên quan đến chọn lọc tự nhiên là sự biệt lập địa lý và cây ký chủ.

Rào cản địa lý. Rào cản địa lý là một yếu tố quan trọng điều khiển sự tiến hóa của tác nhân gây bệnh. Nhiều loài/chủng tác nhân gây bệnh chỉ có mặt ở vùng này mà không có mặt ở vùng khác. Ngoài ra, đặc điểm ngoại cảnh và ký chủ khác biệt nhau giữa các vùng địa lý cũng đóng góp vào yếu tố điều khiển này. Hậu quả của rào cản địa lý là hình thành nên các loài/chủng đặc trưng cho từng vùng địa lý. Ví dụ quần thể vi khuẩn bạc lá của Trung quốc khác Việt Nam dẫn tới nhiều giống lúa lai Trung Quốc, vốn kháng rất tốt bệnh bạc lá tại Trung Quốc, đã không thể kháng được quần thể vi khuẩn bạc lá của Việt Nam.

Cây ký chủ. Đây là một trong các yếu tố chính điều khiển sự tiến hóa của quần thể tác nhân gây bệnh trong một vùng địa lý xác định. Cây ký chủ và tính kháng của nó có thể tác động đến sự tiến hóa của tác nhân gây bệnh ở mức loài hoặc dưới loài. Ví dụ,đã có bằng chứng cho thấy 3 loài nấm P. mirabilis, P. ipomoeae, và P. infestans tiến hóa từ một tổ tiên chung và nhiễm trên 3 họ thực vật hoàn toàn khác nhau. Ở mức dưới loài, hậu quả của tương tác giữa tác nhân gây bệnh với các loài/giống cây ký chủ khác nhau đã dẫn tới hình thành các khái niệm chủng sinh lý (race), dạng chuyên hóa (forma specialis, số ít), biovar, pathovar...của tác nhân gây bệnh (chú ý, đây là các khái niệm phân loại không chính thức dưới loài và khác nhau tùy theo đối tượng nghiên cứu). Ví dụ đối với loài nấm Fusarium oxysporum, hàng chục dạng chuyên hóa (formae speciales, số nhiều) được phân biệt trên cơ sở tính gây bệnh héo với các loài ký chủ khác nhau, Vd: Fusarium oxysporum f.sp. asparagi (măng tây); f.sp. cubense (chuối); f.sp. dianthi (cẩm chướng); f.sp. lycopersici (cà chua); f.sp. niveum (dưa hấu); f.sp. tracheiphilum (đậu tương). Trong mỗi một dạng chuyên hóa, các tác nhân gây bệnh có thể phân nhóm lại thành các race trên cơ sở tính gây bệnh trên các giống cây khác nhau; ví dụ F. oxysporum f.sp. cubense gây bệnh trên chuối gồm 4 race (1,2,3,4). Tương tự, loài vi khuẩn R. solanacearum gồm 5 race được phân biệt dựa trên tính gây bệnh trên các cây ký chủ khác nhau.

Câu 16: Quan hệ đồng tiến hóa giữa gen Avr và R?

· Đồng tiến hóa trong sản xuất nông nghiệp

Trong sản xuất nông nghiệp, người ta thường tạo các giống cây đồng nhất về di truyền, mang tính kháng đặc hiệu chủng. Tuy nhiên, sau một vài năm, tính kháng bị bẻ gẫy. Để duy trì năng suất, người ta lại thay một giống khác mang gen kháng mới và sau một vài năm, tính kháng lại bị mất. Hiện tượng tính kháng bị mất là do trong quần thể tác nhân gây bệnh đã xuất hiện các đột biến tự phát khắc phục được tính kháng.

Việc đưa liên tục các giống kháng mới đã gây ra sự đồng tiến hóa nhân tạo giữa giống kháng đặc hiệu chủng và tác nhân gây bệnh độc đặc hiệu hình thành tự phát. Các lực điều khiển sự đồng tiến hóa này là (i) tốc độ sinh sản và đột biến cao của tác nhân gây bệnh và (ii) việc đưa liên tục các giống kháng mới vào sản xuất.

Quá trình đồng tiến hóa giữa cây trồng và tác nhân gây bệnh gồm nhiều bước:

Giả sử đầu tiên là giống A có kiểu gen r1/r2/rn hoàn toàn bị nhiễm bệnh đối với tác nhân gây bệnh B có kiểu gen Avr1/Avr2/Avrn. Bước đầu tiên là đưa 1 gen kháng R1 vào giống A để có giống kháng R1 có kiểu gen R1/r2/rn. Sự nhận biết đặc hiệu giữa sản phẩm của gen R1 (ký chủ) và Avr1 (ký sinh) đã tạo ra sự kháng bệnh. Bước thứ 2 là sự chọn lọc các cá thể ký sinh mang đột biến tự phát avr1/Avr2/Avrn. Do các cá thể mang đột biến tự phát này mất yếu tố không độc qui định bởi gen Avr1 nên không bị yếu tố kháng qui định bởi gen R1 nhận biết dẫn tới có khả năng gây bệnh trên giống kháng tạo ra ở bước 1. Bước thứ 3, tương tự bước thứ nhất, là tạo ra giống kháng mới mang gen kháng R2 (có kiểu gen R1/R2/rn. Giống kháng này có thể kháng lại chủng tác nhân gây bệnh có kiểu gen avr1/Avr2/Avrn do có sự nhận biết giữa sản phẩm của gen R2 (ký chủ) và Avr2 (ký sinh). Bước thứ 4, tương tự bước thứ 2, là sự chọn lọc các đột biến tự phát các cá thể có kiểu gen avr1/avr2/Avrn hình thành trong quần thể tác nhân gây bệnh. Như vậy sự đồng tiến hóa giữa giống kháng và tác nhân gây bệnh độc trong sản xuất nông nghiệp là cuộc đua không có điểm dừng giữa việc đưa giống kháng mới và sự hình thành - chọn lọc các cá thể độc trong quần thể tác nhân gây bệnh.

Một số điểm chú ý:

Sự hình thành đột biến độc trong quần thể tác nhân gây bệnh không độc ở bước 2 và 4 vốn, về lý thuyết, không thể nhân lên trong quần thể cây kháng là do 1 trong 2 khả năng: (i) đột biến có thể được mang từ nơi khác tới hoặc (ii) đột biến hình thành tại chỗ nếu quần thể tác nhân gây bệnh không độc có thể gây bệnh ở mức độ yếu.

Thời gian tồn tại của giống kháng có thể kéo dài nếu đưa 2 hoặc nhiều gen kháng vào giống kháng. Giống cây càng mang nhiều gen kháng thì cơ hội cho tác nhân gây bệnh không độc có đột biến đồng thời khắc phục tất cả các gen kháng này càng thấp. Tuy nhiên việc tạo giống vừa mang nhiều gen kháng chủ vừa duy trì các tính trạng nông học tốt không dễ dàng.

· Đồng tiến hóa trong hệ sinh thái tự nhiên

Trong hệ sinh thái tự nhiên, cơ chế đồng tiến hóa giữa ký sinh - ký chủ cũng tương tự như trong sản xuất nông nghiệp. Tuy nhiên biểu hiện và hậu quả của sự đồng tiến hóa này có nhiều điểm khác biệt:

Trong hệ sinh thái tự nhiên, tác nhân gây bệnh gây ít thiệt hại hơn nhiều đối với cây so với hệ sinh thái trồng trọt. Các gen kháng đặc hiêu hình thành tự phát trong quần thể cây và sự bền vững của nó chủ yếu bị ảnh hưởng bởi mức độ đa hình của chính nó cũng như sự cân bằng giữa các đột biến độc/không đôc trong quần thể tác nhân gây bệnh. Các yếu tố này thường dẫn tới trạng thái cân bằng về tính kháng của ký chủ và và tính gây bệnh của ký sinh. Trạng thái cân bằng này đảm bảo sự tồn tại của cả cây và tác nhân gây bệnh.

Trạng thái cân bằng giữa ký sinh - ký chủ trong hệ sinh thái tự nhiên có được là do quần thể tác nhân gây bệnh cũng như cây không có kiểu gen đồng nhất trên môt diện tích lớn. Trên một diện tích lớn, chúng thường tồn tại dưới dạng cái gọi là siêu quần thể (metapopulation). Một siêu quần thể gồm nhiều quần thể phụ có đặc trưng kháng/độc khác nhau. Do vậy nếu sự cân bằng về tính kháng (ký chủ)/tính độc (ký sinh) tại một quần thể phụ bị phá vỡ thì một cân bằng mới dễ dàng được thiết lập do sự di chuyển của tác nhân gây bệnh cũng như sự chuyển gen của cây ký chủ thông qua giao phấn hoặc phát tán hạt từ các quần thể phụ lân cận.

Câu 17: Đặc điểm miễn dịch bẩm sinh và tính kháng không đặc hiệu của thực vật đối với tác nhân VSV. Lấy ví dụ 2 loại PAMP/MAMP của tác nhân VSV?

·    Đặc điểm miễn dịch bẩm sinh thực vật:

            Trong đời sống của mình, cây bị tấn công bởi nhiều loại tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên chỉ một số lượng rất nhỏ các tác nhân này có khả năng gây bệnh cho cây.

            Thực vật thiếu một cơ chế miễn dịch thích nghi và di động như ở động vật. Hiện nay, nhiều bằng chứng cho thấy thực vật cũng tồn tại một cơ chế miễn dịch bẩm sinh. Điểm giống nhau cơ bản giữa miễn dịch bẩm sinh của động vật và thực vật là sự nhận biết giữa các receptor của tế bào và các MAM/PAMP của tác nhân gây bệnh.

            Một trong những định nghĩa của tính kháng hay miễn dịch bẩm sinh là "hệ thống giám sát nhằm phát hiện sự có mặt và bản chất của sự xâm nhiễm và tạo ra phòng tuyến phòng thủ của ký chủ. Như vậy miễn dịch bẩm sinh dựa vào khả năng nhận biết của cây đối với ký sinh mà sự nhận biết này có thể trực tiếp hoặc gián tiếp.

            Hiển nhiên miễn dịch bẩm sinh được điều khiển bởi đặc trưng di truyền của ký chủ và là một hệ thống phòng thủ nhiều lớp. Ngay khi vượt qua được lớp rào cản vật lý bên ngoài (bề mặt cây), tác nhân gây bệnh sẽ gặp phải hệ thống cảnh báo là các phân tử receptor trên bề mặt tế bào.

            Khác với động vật, ở thực vật, miễn dịch bẩm sinh bao gồm cả 2 loại đặc hiệu và không đặc hiệu. Dựa vào mức độ đặc hiệu miễn dịch (hay tính kháng) bẩm sinh của cây có thể được chia thành 2 loại là tính kháng không đặc hiêu (tính kháng chung) và tính kháng đặc hiệu.

·    Tính kháng không đặc hiệu của thực vật đối với tác nhân VSV:

            Tính kháng không đặc hiệu hay tính kháng chung có thể được định nghĩa là tính kháng mà tất cả các thành viên (dòng/giống) của một loài cây kháng được tất cả các thành viên (chủng/nòi) của một loài tác nhân gây bệnh.

            Cần chú ý là tính kháng không đặc hiệu còn được gọi là tính kháng cơ bản (basic resistance). Nếu tính kháng cơ bản hình thành từ mối quan hệ tương tác khác dạng (ví dụ như giữa nấm Pyricularia và cây ngô) thì mức độ kháng rất cao hay miễn dịch. Trái lại, nếu tính kháng cơ bản hình thành từ mối quan hệ tương tác cùng dạng (ví dụ giữa nấm đạo ôn và cây lúa) thì mức độ kháng thường thấp (tính kháng ngang) vì tác nhân gây bệnh đã đưa vào trong tế bào nhiều effector ức chế tính kháng cơ bản của cây.

            Về mặt tiến hóa, tính kháng không đặc hiệu cổ hơn tính kháng đặc hiệu.

            Tính kháng không đặc hiệu hình thành dựa trên khả năng của cây nhận biết được các các elicitor chung (general elicitor) của tác nhân gây bệnh. Hiện nay, các elicitor này được gọi là các PAMP (Pathogen-Associated Molecular Pattern). Thuật ngữ PAMP do các nhà nghiên cứu miễn dịch động vật sử dụng đầu tiên và đang dần bị thay thay thế bởi thuật ngữ MAMP (Microbe Associated Molecular Pattern) vì người ta thấy rằng các vi sinh vật không gây bệnh cũng có các PAMP giống như của tác nhân gây bệnh.

            Các PAMP/MAMP nhìn chung đa dạng về bản chất hóa học, thường là các chuỗi peptide, glycoprotein, lipids và oligosaccharides có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh và không gây bệnh.

            Điểm chú ý là trong quá trình gây bệnh, các tác nhân gây bệnh, thông qua các hoạt động enzyme thủy phân, cũng tạo ra các chất có nguồn gốc từ vách tế bào thực vật mà các chất này cũng đóng vai trò như elicitor kích hoạt phản ứng phòng thủ của cây. Các chất có nguồn gốc từ ký chủ như trên được gọi là các mô hình phân tử (có nguồn gốc ký chủ) được cảm ứng bởi tác nhân gây bệnh và được ký hiệu là MIMPs (Microbe-Induced Molecular Patterns). Như vậy cây không chỉ nhận biết và phản ứng với các dấu hiệu có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh mà còn có nguồn gốc từ chính cây.

Các PAMP/MAMP hiển nhiên khá bảo thủ trong một nhóm tác nhân gây hại. Một số các MAMP/PAMP chung nổi tiếng là:

§ Lypopolysaccharide (LPS). LPS có nguồn gốc từ các vi khuẩn gram (-) như Xanthomonas, Pseudomonas...LPS cảm ứng để tạo ra sự cháy oxy hóa, hình thành các enzyme kháng sinh.

§ Flagellin. Là protein cấu tạo nên lông roi vi khuẩn gram (-). Mỗi lông roi bao gồm hàng ngàn tiểu phần flagellin. Flagellin chứa một motif nhận biết gồm 22 aa (đoạn fgl22). Flagellin có thể cảm ứng tạo để hình thành callose và các phản ứng phòng thủ khác như hình thành PR protein.

§ Harpin. Harpin là các protein được mã hóa bởi gen hrp (viết tắt của hypersensitive response and pathogenicity) của vi khuẩn gram (-). Phần lớn các loài vi khuẩn có 2 cum gen hrp. Cụm lớn gồm 6-9 đơn vị phiên mã, mỗi đơn vị mã hóa 1-9 protein. Các protein harpin nằm trên màng tế bào vi khuẩn, tham gia cấu tạo nên hệ thống tiết loại III của vi khuẩn. Hệ thống tiết loại III sẽ vận chuyển Avr protein và cả harpin vào trong tế bào cây. Harpin cảm ứng để tạo phản ứng siêu nhạy/apoptosis và các phản ứng phòng thủ khác.

§ Chitin. Chitin là các phân tử oligomer có nguồn gốc từ vách tế bào nấm. Chitin có thể cảm ứng hình thành phytoalexin và lignin hóa tế bào cây.

§ Glucan. Glucan có nguồn gôc từ vách tế bào nấm, đặc biệt là nấm trứng như Phytophthora. Glucan có thể cảm ứng cây hình thành phytoalexin.

§ Glycoprotein. Glicoprotein có nguồn gốc từ vách tế bào nấm trứng như Phytophthora. Glycoprotein có thể cảm ứng cây hình thành phytoalexin.

Câu 18: Đặc điểm nhận biết và tương tác giữa các protein R và PAMP/ MAMP/ Effector?

·   Các receptor nhận biết PAMP/MAMP/Avr protein: Các receptor này thường được phân nhóm thành (i) các receptor nhận biêt PAMP/MAMP (đối với tính kháng không đặc hiệu)  và (ii) các protein R (đối với tính kháng gen-for-gen). Các receptor nhận biết các MAMP/PAMP thường là các protein xuyên màng và có vùng lặp giàu leucin nằm phía bên ngoài tế bào. Tuy nhiên, cơ sở cho việc phân chia này không phải lúc nào cũng rõ ràng, vì vậy người ta có thể gộp chung cả 2 nhóm thành protein kháng R.

· Nhận biết và tương tác giữa các protein R và PAMP/MAMP/Effector:

Sự nhận biết và tương tác này tuân theo 1 trong 2 cơ chế trực tiếp hoặc gián tiếp (xem lại phần tương tác trực tiếp và tương tác gián tiếp).

Vai trò của Effector (chất hiệu ứng): Như đã biết, effector là phân tử có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh tác động lên tế bào ký chủ, nhờ đó tạo điều kiện cho sự nhiễm bệnh.

Đối với cây, sự nhận biết các elicitor chung (MAMP/PAMP) đã hình thành tính kháng cơ bản. Tính kháng này còn được gọi là tính kháng khởi động bởi MAMP/PAMP. Tính kháng này có thể hiệu quả dẫn tới cây không bị bệnh.

Tuy nhiên, tác nhân gây bệnh có thể khắc phục tính kháng cơ bản bằng cách tiết vào tế bào cây các effector. Một vi khuẩn gây bệnh (vd Pseudomonas syringae) trong quá trình gây bệnh có thể tiết vào trong tế bào thực vật từ 20 -30 effector khác nhau thông qua hệ thống tiết loại III. Tương tự, các loại nấm biotroph cũng tiết vào tế bào cây nhiều effector thông qua vòi hút (haustorium) hình thành bên trong tế bào (vd nấm gỉ sắt cây lanh M. lini tiết vào tế bào tới 21 loại effector khác nhau). Nhiều effector của tác nhân gây bệnh có hoạt tính enzym, có vai trò biến đổi các protein của ký chủ nhằm tạo điều kiện cho sự gây bệnh và làm mất khả năng nhận biết của cây. Một trong các vai trò của các effector này là ức chế phản ứng phòng thủ của cây thông qua nhận biết PAMP/MAMP. Một số các protein của virus thực vật (Vd: HP = Helper Component) của các potyvirus) có khả năng ức chế phản ứng phòng thủ của cây thông qua cơ chế gene silencing cũng có thể được xem là effector của virus. Nếu hoạt động của các effector này hiệu quả, cây sẽ bị nhiễm bệnh.

2        Các effector của tác nhân gây bệnh được nghiên cứu nhiều nhất là các Avr protein. Nếu cây có gen R có thể nhận biết được các Avr protein thì một lớp phản ứng kháng thứ 2 sẽ hình thành và  được gọi là tính kháng khởi động bởi effector. Tính kháng khởi động bởi effector hiển nhiên là đặc hiệu và thường tuân theo quan hệ gen-đối-gen.

Câu 19: Đặc điểm dẫn truyền tín hiệu SA và JA/ET trong hình thành tính kháng (chỉ cần lấy 2 ví dụ mỗi loại để chứng minh mỗi đường hường). Quan hệ giữa 2 đường hướng.?

Phản ứng phòng thủ tạo được của cây điều khiển bởi một mạng lưới các đường hướng dẫn truyền tín hiệu chồng chéo lên nhau. Nhiều phân tử tham gia các đường hướng dẫn truyền tín hiệu.

·  Đường hướng salicyclic acid (SA)

Salicyclic acid (SA) là một phytohormon, có vai trò quan trọng trong phát triển, quang hợp, hô hấp... của thực vật.

SA cũng là một phân tử tín hiệu nội sinh tham gia cảm ứng tính kháng tạo được của thực vật. Vai trò của SA trong dẫn truyền tính kháng đã được chứng minh trong một số thí nghiệm:

Xử lý SA trên cây thuốc lá đã dẫn tới giảm triệu chứng bị nhiễm bởi TMV và  tích lũy nhiều PR protein (thí nghiệm của White, 1970).

Lây nhiễm TMV trên thuốc lá dẫn tới hàm lượng SA tăng cục bộ (tại vị trí lây nhiễm) và hệ thống (toàn cây).

Cây Arabidopsis chuyển gen NahG (naphthalene hydroxylase G) của vi khuẩn Pseudomonas putida (là gen mã hóa salicylate hydroxylase, một enzyme chuyển SA thành dạng bất hoạt là catechol) đã biểu hiện tính mẫn cảm cao đối với nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau như nấm, vi khuẩn và virus.

Cây chứa các đột biến mất khả năng tích lũy SA như eds4, eds5 (enhanced disease susceptibility), sid1, sid2 (SA induction-deficient), pad4 (phytoalexin-deficient) biểu hiện tính mẫn cảm cao với tác nhân gây bệnh.

SA tương tác với catalase - là một enzyme xúc tác cho sự phân hủy H2O2 thành H2O và O2. H2O2  là phân tử hoạt động phía thượng lưu của quá trình dẫn truyền tín hiệu. Phía hạ lưu của đường hướng dẫn truyền tín hiệu (phía sau SA) là một protein gọi là NPR1 (non-expressor of PR1 protein) cần cho dẫn truyền SA. Sản phẩm cuối cùng của đường hướng dẫn truyền SA là các loại PR protein, trong đó quan trọng nhất là protein nhóm PR1.

Đường hướng dẫn truyền SA thường do các tác nhân gây bệnh nhóm biotroph gây ra. Nhìn chung các tác nhân gây bệnh này sinh trưởng trong gian bào và nhân lên trong mô nhiều ngày trước khi gây chết hoại mô.

·  Đường hướng dẫn truyền JA và ET

            Jasmonic acid (JA) và ethylen (ET) cũng là các phytohormon. Cả JA và ET đã được chứng minh có vai trò trong tính kháng bệnh như trong các ví dụ sau:

Cây Arabidopsis mang đột biến mất khả năng hình thành JA như fad3/fad7/fad8 (3 đột biến gen fatty acid desaturase) hoặc mất khả năng tiếp nhận JA như coi1 (coronatine insensitive 1) hoặc kháng JA như jar1 (jasmonic acid resistant1) biểu hiện tính mẫn cảm đối với một loạt tác nhân  gây bệnh như nấm Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea, Pythium, vi khuẩn Erwinia carotovora.

Cây Arabidopsis mang đột biến trơ với ET như ein2 (ethylene insensitive2) biểu hiện tính mẫn cảm với nấm  B. cinerea và vi khuẩn  E. carotovora.

Xử lý JA hoặc ET đã dẫn đến là cây biểu hiện gen PDF1-2 (mã hóa protein phòng thủ là defensin) và Thi2-1 (mã hóa protein phòng thủ là thionin), hel (hevein-like protein) và chib (chitinaseB). Các gen này được xem là dấu hiệu phổ biến của đường hướng dẫn truyền JA/ET.

Đường hướng JA/ET có nhiều điểm khác với đường hướng SA: (1) JA/ET hình thành chủ yếu do nhóm necrotroph như nấm Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea, Pythium, vi khuẩn Erwinia carotovora. Các tác nhân này giết chết nhanh chóng tế bào cây để hấp thu dinh dưỡng; (2) sự tích lũy JA và ET có thể hình thành do tác nhân gây bệnh, nhưng cũng có thể hình thành từ các tổn thương do côn trùng .

Câu 20: Đặc điểm của dòng thác ion và sự đốt cháy oxy hóa trong tương tác ký sinh - ký chủ?

Trên màng tế bào ký chủ có các receptor ngoại bào (ví dụ như FLS2). Ngay sau khi cây ký chủ nhận biết được sự có mặt của tác nhân gây bệnh tại màng tế bào, có sự thay đổi về dòng ion đi vào/ra tế bào qua kênh ion dẫn tới thay đổi cân bằng K+/H+ của màng (dòng Ca2+ và H+ vào tế bào tăng, dòng K+ và Cl- ra khỏi tế bào tăng). Phản ứng lại sự thay đổi này là sự hoạt hóa các protein liên kết màng như kinase, phosphatase, phospholipase và protein G. Các kinase sẽ hoạt hóa NADPH oxidase để chuyển O2 thành các lớp oxy hoạt hóa (ROS= reactive oxygen classes) như H2O2, O2-, HO2. Ngoài ra, các kinase cũng hoạt hóa nitric oxydase để tổng hợp nitric oxide (NO) khi sử dụng năng lượng từ NADPH.

Các lớp oxy hóa khử (đặc biệt là H2O2) và NO sẽ ảnh hưởng đến tính kháng bằng 2 cách:

6        ROS, đặc biệt là H2O2,  sẽ hoạt động trên màng/vách. ROS có thể cảm ứng quá trình lignin hóa vách tế bào hoặc liên kết các hợp chất của vách tế bào (crosslinking). ROS cũng có thể oxy hóa các hợp chất đặc biệt là lipid của màng tế bào, ví dụ tạo thành các lipid hydroperoxide là các chất độc đối với tế bào. ROS cũng có thể oxy hóa các hợp chất phenolic thành các chất quinon độc với tế bào. Hậu quả là tế bào bị chết nhanh chóng (phản ứng siêu nhạy HR). Cần chú ý trong quá trình cảm ứng phản ứng siêu nhạy này có vai trò của NO. Người ta đã chứng minh rằng sự cân bàng NO/ H2O2 là cần thiết để cảm ứng phản ứng siêu nhạy.

7        H2O2 và NO tham gia dẫn truyền tín hiệu cho các đường hướng dẫn truyền tín hiệu hoặc phòng thủ khác. Ví dụ H2O2 có thể cảm ứng đường hướng MAPK hoặc cảm ứng để tổng hợp phenylalanin ammonia lyase (PLA), một enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp SA.

Câu 21: Đặc điểm và ví dụ (flagellin) về đường hướng dẫn truyền tín hiệu MAPK trong tương tác ký sinh - ký chủ?

·    Đường hướng MAPK là đường hướng dẫn truyền chủ chốt đối với tính kháng bệnh. Đây là một đường hướng chung đối với sinh vật nhân thật và là một cách dẫn truyền các tín hiệu ngoại bào thông qua các receptor bề mặt. Đường hướng MAPK dựa vào sự nhận biết thông qua PAMP/MAMP.

·    Sự nhận biết giữa receoptor của ký chủ và PAMP/MAMP của vi sinh vật (Vd: flg22, HrpZ, EF-Tu của vi khuẩn, Pep 13, NPP1, glucan của nấm trứng, chitin và ergosterol của nấm thật) dẫn tới một dòng thác dẫn truyền tín hiệu trong tế bào gọi là đường hướng dẫn truyền MAPK (Mitogen Activated Protein Kinases). MAPK là một protein kinase đặc hiệu serin/threonin có nghĩa nó sẽ phosphorin hóa nhóm OH của serin hoặc threonin. Một dòng thác MAPK nhìn chung là chuỗi MAPKKK=>MAPKK=>MAPK cho phép truyền các dấu hiệu ngoại bào thông qua receptor thành một loạt các phản ứng nội bào. Ví dụ bộ gen của Arabidopsis mã hóa ít nhất 20 MAPKs. Sự hoạt hóa dòng thác MAPK sẽ kích hoạt yếu tố phiên mã WRKY trong nhân tế bào và dẫn tới kích hoạt quá trình phiên mã của nhiều gen phòng thủ (WRKY là một họ protein có khả năng liên kết với promoter của các gen kháng).

·    Ví dụ đường hướng MAPK.

Flagellin là một loại PAMP chung được nghiên cứu nhiều nhất trong số các PAM/MAMP của vi khuẩn hại thực vật. Flagellin là protein cấu trúc của lông roi vi khuẩn. Flagellin chứa một đoạn 22 amino acid bảo thủ gọi là fgl22. Fgl22 có thể được nhận biết bởi một receptor của tế bào thực vật là FLS2. FLS2 là một receptor kinase xuyên màng với đoạn lặp giàu leucin (LRR) nằm phía ngoài màng tế bào (chịu trách nhiệm nhận biết) và một vùng có hoạt tính kinase nằm trong tế bào chất.

Ngay sau khi FLS2 nhận biết sự có mặt của fgl22, vùng kinase của nó sẽ khởi động đường hướng MAPK bằng cách hoạt hóa các kinase của tế bào là AtMEKK1=> AtMKK4/5=>AtMPK3/6, dẫn tới khởi động các yếu tố phiên mã hoạt động trong trong nhân (Vd: như yếu tố WRKY) và cuối cùng tổng hợp các hợp chất tạo ra tính kháng (vd như các PR protein).

Câu 22: Định nghĩa và đặc điểm của tính kháng tập nhiễm hệ thống (SAR). Đặc điểm của các chất kích kháng. Mô tả đặc điểm và vai trò của SA và BTH trong cảm ứng SAR?

Định nghĩa: Cây trồng trong quá trình tiến hóa đã phát triển một số cơ chế phòng thủ chống lại tác nhân gây bệnh. Trong những năm 1960, Ross đã quan sát thấy rằng khi lây nhiễm nhân tạo cây thuốc lá với virus TMV sẽ hình thành tính kháng hệ thống vì khi lây nhiễm tiếp TMV lần thứ 2 tại vị trí cách xa điểm lây nhiễm lần đầu thì vết chết hoại hình thành nhỏ hơn. Tính kháng kiểu này đã được gọi là tính kháng tập nhiễm hệ thống (SAR). Định nghĩa. SAR là loại tính kháng tạo được có tính lưu dẫn (hệ thống), phổ rộng (chống lại nhiều tác nhân gây bệnh), thường dẫn tới biểu hiện PR protein và thông qua hệ đường hướng dẫn truyền tín hiệu SA, JA/ET.

Đặc điểm của tính kháng tập nhiễm hệ thống (SAR):

SAR có thể được hình thành trên nhiều loài cây bởi các tác nhân gây vết bệnh chết hoại (là biểu hiện của phản ứng siêu nhạy hoặc là biểu hiện của triệu chứng).

Cần chú ý nếu tính kháng tạo được nhưng không lưu dẫn tức tính kháng chỉ hình thành xung quanh vị trí xâm nhiễm thì được gọi là tính kháng tập nhiễm cục bộ (local acquired resistance).

Dấu hiệu phân tử tín hiệu đặc trưng của SAR là SA có thể được tạo ra rất nhanh trong vòng vài giờ (4-6 giờ) sau lây nhiễm và nhân lên nhanh chóng; sau  khoảng 24 giờ SAR đã biểu hiện toàn cây. Sự di chuyển của SAR thường theo hướng từ dưới gốc lên trên ngọn.

3        Cây có thể duy trì SAR trong thời gian rất lâu, trong nhiều trường hợp kéo dài cả đời của cây.

Đặc điểm của các chất kích kháng:

SAR hình thành khi có sự tấn công của tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên nhiều thí nghiệm đã chứng tỏ rằng SAR có thể được tạo ra khi xử lý các hợp chất tự nhiên hoặc tổng hợp. Tất cả các hóa chất có khả năng cảm ứng SAR được gọi là các chất kích hoạt SAR (chất kích kháng).

Để có thể được xem là chất kích hoạt SAR thực sự, một hóa chất hoặc sản phẩm chuyển hóa của nó phải không có hoạt tính kháng sinh. Một số thuốc hóa học trừ bệnh ngoài hoạt tính kháng nấm còn có khả năng cảm ứng SAR như Fosetyl-Al (Aliet), metalaxyl, Cu(OH)2. Một số hóa chất cảm ứng SAR phổ biến bao gồm: SA, INA, BTH, Chitosan.

4        Đặc điểm và vai trò của SA và BTH trong cảm ứng SAR:

o SA (salicylic acid). Xem câu 19 đường hướng dẫn truyền SA

o INA (dichloroisonicotinic acid). INA có cơ chế cảm ứng SAR giống như  SA chống lại nhiều tác nhân gây bệnh. INA có thể cảm ứng SAR trước hoặc sau khi lây nhiễm. Điểm khác biệt so với SA là INA cảm ứng SAR độc lập với SA và hoạt động ở phía hạ lưu đường hướng dẫn truyền tín hiệu so với SA.

o BTH (benzo(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothiolic acid (BTH, acibenzolar-S-methyl). BTH là sản phẩm của hãng Novartis (bán tại Việt Nam với tên thương mại là BION). BTH có thể cảm ứng SAR ở liều lượng thấp, do vậy tránh được hiệu ứng gây độc cho cây. BTH có cơ chế tạo SAR giống như SA và có thể chống được nhiều nhóm tác nhân gây hại kể cả virus. BTH có hiệu quả chống nấm Cercospora nicotianae, Peronospora tabacina, Phytophthora parasitica, nhiều nấm phấn trắng, gỉ sắt và sương mai khác, vi khuẩn Pseudomonas syringae, virus TMV, CMV và TSWV.

Chitosan. Các oligomer của chitosan hình thành từ sự loại bỏ nhóm acetyl của chitin (dạng polymer mach thẳng của N-acetyl-D-glucosamine). Chitosan có khả năng kháng nấm trực tiếp (biến đổi cấu trúc vách tế bào nấm, ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chitin của vách tế bào nấm). Ngoài ra, chitosan cũng được biết là cảm ứng hình thành SAR .

Câu 23: Đặc điểm xâm nhiễm gây bệnh của nấm đạo ôn (Pyricularia oryzae). Đặc điểm của Pita gen. Trình bày mức độ đa dạng của quần thể nấm đạo ôn ở miền Bắc?

Đặc điểm xâm nhiễm gây bệnh của nấm đạo ôn (Pyricularia oryzae):

Nấm gây bệnh có tên giai đoạn vô tính là Pyricularia oryzae (syn. Piricularia oryzae). Giai đoạn hữu tính của nấm đã được đặt tên là Magnaporthe grisea và gần đây (2004), dựa vào các nghiên cứu phân tử, được đặt tên lại là M. oryzae.

Nấm thuộc lớp nấm túi (Ascomycetes), tuy nhiên ngoài tự nhiên nấm chỉ sinh sản vô tính tạo cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh không màu, 2 vách ngăn, hình quả lê (hoặc nụ sen).

Xâm nhiễm gây bệnh.

Nấm đạo ôn là nấm bán sinh dưỡng (hemibiotroph) với pha sinh dưỡng biotroph ở giai đoạn sớm của quá trình xâm nhiễm.

8        Giai đoạn sớm của quá trình xâm nhiễm bao gồm pha tiền xâm nhập (prepeneration): bào tử nấm tiếp xúc trên bề mặt lá, đỉnh bào tử nứt vỡ và tiết ra một giọt chất nhầy gắn kết chặt bào tử và bề mặt lá. Lớp chất nhày này chứa các hợp chất cacrbonhydrate và glycoprotein.

            Tiếp theo, bào tử nấm nảy mầm tạo ống mầm, hình thành một tế bào ở đỉnh ống mầm và phát triển thành vòi áp (appressorium). Vòi áp của nấm là một cấu trúc dạng vòm, có vách dày, mầu đậm do bị melanin hóa. Sự melanin hóa làm vách vòi áp trở nên chắc chắn hơn. Bên trong vòi áp, nấm tích lũy nhiều glycerol và do vậy áp lực trương của vòi áp nấm đạo ôn rất lớn, có thể tới 80 at.

Tiếp theo quá trình tiền xâm nhập là xâm nhập của bào tử: Từ vòi áp sẽ hình thành một sợi nấm nhỏ gọi là đế xâm nhập (infection peg) để xâm nhập trực tiếp qua tầng cutin và vào bên trong tế bào biểu bì. Bên trong tế bào biểu bì, đỉnh đế xâm nhập sẽ phình to tạo thành vòi hút (haustorium). Nấm sẽ tiết các enzyme và effector qua màng vòi hút vào tế bào chất của tế bào ký chủ và hấp thụ dinh dưỡng. Trong quá trình dinh dưỡng, vách tế bào ký chủ dần dần sụp đổ và nấm tiếp tục phát triển sang tế bào bên cạnh (thông qua sợi liên bào) và lại tiếp tục hình thành vòi hút ở tế bào mới bị xâm nhập.

            Nhiều yếu tố dẫn truyền tín hiệu tham gia vào quá trình nhận biết và hình thành vòi áp của nấm P. oryzae. Sự hình thành vòi áp chỉ xuất hiện trên bề mặt cứng (như bề mặt lá). Hai yếu tố chính tham gia vào quá trình dẫn truyền tín hiệu để hình thành vòi áp là chất lượng và bản chất hóa học của sự gắn kết.

2        Bề mặt bào tử nấm có chứa một lớp protein gọi là hydrophobin (Mpg1 protein) với phía ưa nước hướng vào tế bào nấm và phía ghét nước hướng về bề mặt của lá. Lớp hydrophobin giúp bào tử nhận biết được bề mặt ghét nước của lá và có vai trò quan trọng trong hình thành vòi áp.

            Một số gen của nấm (vd MagA, MagB) cảm ứng hình thành cAMP (cyclic adenosine monophosphate), một phân tử dẫn truyền tín hiệu kích thích hình thành vòi áp.

            Đặc điểm của Pita gen:

            Hiện có khoảng 40 gen kháng chủ đối với nấm P.oryzae đã được xác định trên lúa với khoảng gần 10 gen đã được clone. Trong số các gen này, Pi-ta là gen kháng được nghiên cứu nhiều nhất.

Pi-ta là gen nằm ở vùng trung tâm của nhiễm sắc thể số 12. Protein Pi-ta là một protein (928 aa) kháng R thuộc lớp CNL (CC-NB-LRR) hoạt động tại tế bào chất. Vùng lặp giàu leucine (LRR) của Protein Pi-ta tương tác trực tiếp với AvrPi-ta để tạo tính kháng. Các allen pi-ta (lặn) ở các giống nhiễm bệnh mã hóa cho một protein chỉ khác 1 aa so với allen Pi-ta (trội). Các gen kháng như Pi-ta2 là gen allen của Pi-ta.

9        Nấm M. oryzae tạo ra 3 nhóm Avr protein có thể được nhận biết ở mức đặc hiệu giống, trong đó quan trọng nhất là AvrPita protein. AvrPita gen nằm ở gần đầu nhiễm sắc thể của nấm và mất đỉnh nhiễm sắc thể nấm (chứa AvrPita gen) là một cơ chế dẫn tới nấm có khả năng gây bệnh. AvrPita có bản chất protease và tương tác với protein kháng tương ứng của ký chủ là Pita protein. Tương tác giữa AvrPita và Pita là tương tác trực tiếp.

Vách tế bào

Màng tế bào                

            Mức độ đa dạng của quần thể nấm đạo ôn ở miền Bắc:

o  Đa dạng của nấm/ Bộ giống chỉ thị

§ Nấm Pyricularia oryzae được xem là một quần thể không đồng nhất. Dựa trên các phân tích phân tử, nhìn chung nấm được phân nhóm trên cở sở phân bố địa lý (vd: nhóm châu Mỹ, châu Âu, Nhật bản, Iran...). Nhìn chung, các quần thể nấm thuộc các khu vực khởi nguyên cây lúa (chẳng hạn ở khu vực dãy Hymalaya, hoặc Đông Nam Á) có mức độ đa dạng cao hơn.

§ Thông tin về mức độ đa dạng di truyền của bất kỳ quần thể tác nhân gây bệnh nào đều cần thiết cho các chương trình chọn tạo giống kháng bệnh. Đối với nấm đạo ôn, vào năm 1967, IRRI đã thiết lập một hệ thống phân biệt các chủng sinh lý race/pathotype của nấm dựa trên một bộ giống chỉ thị gồm 8 giống, theo thứ tự là: Raminad, Zenith, NP-125, Usen, Dular, Kanto 51, Sha-tiao-tsao, Caloro. Hệ thống phân biệt các race nấm này vẫn được sử dụng tại nhiều nước trên thế giới.

§ Các race nấm, được thử tính gây bệnh trên bộ giống này, sẽ được ký hiệu như sau: I (từ international); tiếp theo là 1 trong các chữ A, B, C, D, E, F, G, H, (mỗi chữ đại diện cho một giống chỉ thị và tương ứng với giống mẫn cảm đầu tiên khi thử trên tám giống theo thứ tự ở trên); cuối cùng là một số chỉ kiểu tính độc. Ví dụ một isolate nấm có phản ứng S, R, R, R, R, R, R, R (S = susceptible, R = resistant) có ký hiệu là IA. Dựa vào hệ thống này, tối đa 256 nhóm chủng (28) có thể được phân biệt, trong đó lần lượt 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2 và 1 nhóm chủng ở các nhóm chủng IA, IB, IC, ID, IE, IF, IG và IH.

§ Tuy nhiên vì bộ giống chỉ thị này chỉ chứa ít gen kháng (khoảng 5 gen) nên không thể đánh giá được mức độ đa dạng của nấm. Hiện nay, ngoài bộ giống chỉ thị trên, các nước đều phát triển bộ giống chỉ thị riêng, đặc biệt sử dụng các dòng gần đẳng gen (near isogenic lines) chứa 1 hoặc vài gen kháng.

o  Quần thể nấm P. oryzae tại miền Bắc Việt Nam

§ Sử dụng kỹ thuật AFLP, Nguyễn Thị Ninh Thuận (2006) đã nghiên cứu mức độ đa dạng và tính gây bệnh của 114 isolates nấm thu thập tại nhiều tỉnh thuộc đồng bằng sông Hồng. Nghiên cứu này cho thấy:

§ Quần thể nấm P. oryzae tại đồng bằng sông Hồng có tính đa dạng cao gồm 7 nhóm VNG1, VNG2,..., VNG7.

§ Quần thể nấm phân lập trên các giống lúa tẻ khác quần thể nấm phân lập trên các giống lúa nếp. Quần thể nấm trên lúa tẻ gồm 4 nhóm VNG1, VNG2, VNG3 và VNG4, còn trên lúa nếp gồm 3 nhóm VNG 5, VNG6 và VNG7.

§ Các nhóm VNG1, VNG3, VNG 4 chiếm ưu thế với VNG1 chiếm tới hơn 50%.

§ Nhiều giống chỉ thị mang nhiều gen kháng có thể chống được quần thể nấm P. oryzae của miền Bắc (ví dụ giống Morobenekan mang các gen kháng Pi-7(t), Pi-10(t), Pi-12(t), Pi-44(t), Pi-157), tuy nhiên không thể biết được gen nào điều khiển tính kháng.

§ Dựa trên phản ứng của đại diện các nhóm đối với các giống chỉ thị có số lượng gen kháng ít, các gen kháng sau nên được sử dụng để tạo giống kháng nấm đạo ôn ở miền Bắc: Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-ta2, Pi-k.

o Các giống kháng nhiễm

§ Việt Nam thuộc khu vực khởi nguyên của cây lúa với tập đoàn giống phong phú. Nhiều giống cổ truyền của Việt Nam mang các gen kháng bệnh đạo ôn quí. Hiện nay, Việt Nam có ít nhất 1 giống lúa cổ truyền là Tetep đang được nhiều nước sử dụng (thông qua IRRI) làm vật liệu nghiên cứu tính kháng. Tetep là một giống có tính kháng cao đối với rất nhiều chủng đạo ôn; một số gen kháng đã được xác định trên giống này như Pi-3(t), Pi-ta, Pi-ta2, Pi-tp(t).

§ Ở Việt Nam, một số giống lúa kháng đạo ôn đã được tạo ra như C70, C71, IR1820, X20, X21.

§ Hiện nay, một số giống lúa trồng phổ biến ở miền Bắc có chất lượng và năng suất tốt như Khang Dân 18, Bắc Thơm số 7, Hương Thơm số 1, Nếp IR352... đều nhiễm nấm đạo ôn.

Câu 24 : Đặc điểm xâm nhiễm của vi khuẩn bạc lá lúa (Xanthomonas oryzae pv. oryzae). Mô tả đặc điểm và tương tác của Xa21, xa5 và Xa27?

Bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra. Vi khuẩn lúc đầu được đặt tên là Bacillus oryzae, đổi tên thành X. oryzae (năm 1922). Năm 1978, vi khuẩn được đặt lại tên là Xanthomonas campestris pv. oryzae và vào năm 1990, vi khuẩn được phân loại lại với tên hiện đang được sở dụng là Xoo.

Xo là vi khuẩn gram (-) hình gậy, 2 đầu tròn, kích thước (0.7-2) x (0.4-0.7), vi khuẩn di động với một lông roi. Khuẩn lạc trên môi trường nhân tạo tròn, lồi, nhầy, màu vàng (do hình thành sắc tố xanthomonadin). Xoo tạo nhiều polysacharide ngoại bào EPS (= extracellualar polysacharide), có vai trò quan trọng trong việc hình thành giọt dịch vi khuẩn trên lá bệnh, bảo vệ vi khuẩn khỏi bị khô và tạo điều kiện cho vi khuẩn phát tán nhờ gió, mưa. Vi khuẩn hảo khí bắt buộc, không hình thành bào tử, nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 25-30OC.

Đặc điểm xâm nhiễm của vi khuẩn bạc lá lúa (Xanthomonas oryzae pv. Oryzae) :

o Xoo xâm nhập vào lá qua thủy khổng ở mép lá và chót lá là chủ yếu. Vi khuẩn trên bề mặt lá có thể di chuyển trên màng nước (nhiều vào ban đêm) để xâm nhập vào thủy khổng. Sau khi xâm nhập vào bên trong, vi khuẩn nhân lên trong gian bào và tiếp theo, xâm nhập và lan truyền trong lá theo mạch xylem. Vi khuẩn cũng có thể xâm nhập vào xylem qua tổn thương cơ giới hoặc lỗ mở khi rễ mới hình thành ở gốc bẹ lá.

o Bên trong xylem, vi khuẩn di chuyển theo chiều dọc theo gân chính của lá nhưng cũng có thể từ xylem, di chuyển sang 2 bên. Trong vòng vài ngày, tế bào vi khuẩn và EPS lấp đầy mạch xylem và tiết dịch vi khuẩn qua thủy khổng thành giọt dịch hoặc sợi dịch vi khuẩn (dấu hiệu đặc trưng của bệnh và là nguồn bệnh thứ cấp quan trọng).

o (Phân biệt với đốm sọc vi khuẩn (Xoc) : Xoc xâm nhập chủ yếu qua khí khổng, nhân lên trong xoang khí khổng, sau đó phát triển trong gian bào của nhu mô).

Đặc điểm và tương tác của Xa21, xa5, Xa27 :

Các gen kháng lúa đã được bắt đầu nghiên cứu tại Nhật và IRRI khảng 30 năm trước đây. Tạo giống kháng mang gen kháng chủ là cách phòng chống hiệu quả nhất đối với bệnh bạc lá. Cho tới nay (tính tới 2007), khoảng 29 gen kháng Xoo (ký hiệu từ Xa1 tới Xa29) đã được khám phá trên lúa, trong số đó, 19 là gen kháng trội. Sáu gen (Xa1, Xa5, Xa21, Xa26 và Xa27) đã được phân lập và giải trình tự. Trong số 6 gen này, 2 gen Xa21 và Xa26 có đặc điểm giống như các receptor. Một số gen Xa quan trọng là :

Xa21. Đây là gen đầu tiên trong số các gen kháng được phân lập trên lúa. Xa21 được phân lập đầu tiên từ cây lúa dại Oryzae longistaminata, tiếp theo được chuyển vào giống IR24 để tạo ra dòng gần đẳng gen IRBB21. Xa21 là một protein xuyên màng giống như receptor bề mặt có cấu tạo gồm một  đầu LRR bên ngoài màng có chức năng nhận biết, một phần xuyên màng và một đầu có hoạt tính kinase có chức năng truyền tín hiệu. Xa21 là một gen kháng chủ, trội, phổ rộng chống nhiều chủng Xoo (ít nhất đã được chứng minh trên nhiều chủng của Ấn Độ, Philippin). Ngoài ra Xa21 có khả năng kháng cao và đặc hiệu đối với các chủng Xoo thuộc race 1 của Nhật Bản và được sử dụng rộng rãi trong các chương trình tạo giống kháng bạc lá ở Nhật. Xa21 sẽ được biểu hiện khi lây nhiễm nhân tạo Xoo hoặc khi gây tổn thương cơ giới trên cây. Xa21 là một gen R qui định tính kháng vào giai đoạn trưởng thành của cây lúa.

xa5. Đây  gen kháng lặn, qui định tính kháng phổ rộng (ít nhất đã được chứng minh trên nhiều race Xoo của Philippin và Việt Nam). xa5 mã hóa tiểu phần γ của yếu tố phiên mã TFIIA (yếu tố phiên mã hoàn chỉnh - ký hiệu là TFIIAγ). Tính kháng lặn của xa5 có thể được giải thích như sau : xa5 và Xa5 mã hóa các isoform của TFIIAγ (chỉ khác nhau ở aa số 39) và do đó có ái lực liên kết khác nhau với vùng hoạt hóa phiên mã (Activated Domain - AD) của AvrXa5 của vi khuẩn (AvrXa5 là một Avr thuộc họ AvrBs3 của vi khuẩn). AvrXa5 liên kết với isoform TFIIAγ Xa5 (gen trội trên giống nhiễm) dẫn tới hoạt hóa các gen của ký chủ có lợi cho sự gây bệnh. Trái lại AvrXa5 không liên kết với isoform TFIIAγ xa5 (gen lặn trên giống kháng) dẫn tới các gen của ký chủ có lợi cho sự gây bệnh không được biểu hiện, hậu quả là cây kháng bệnh.

4        Xa1. Đây là gen kháng trội thuộc nhóm NBS-LRR. Xa1 có đặc điểm cấu trúc và chức năng tương tự gen RPS2 trên cây Arabidopsis, gen N trên cây thuốc lá và gen L6 trên cây lanh. Tổn thương cơ giới và sự nhiễm bệnh do Xoo cảm ứng biểu hiện gen Xa1. Xa1 qui định tính kháng cao nhưng phổ hẹp, chống được các chủng thuộc race 1 của Nhật.

            Xa27. Đây là gen kháng phổ rộng chống được nhiều chủng Xoo. Tính kháng của Xa27 di truyền theo kiểu bán trội. Các allen của locus Xa27 mã hóa cho các protein đồng nhất (có nghĩa protein Xa27 giống hệt protein xa27). Điều này cho thấy sự khác nhau về tính kháng ở cây Xa27 và tính mẫn cảm ở cây xa27 là do sự khác nhau về trình tự nts trên vùng promotor của gen Xa27/xa27. Người ta đã chứng minh bằng thực nghiệm là chỉ gen Xa27 được biểu hiện khi nhiễm với Xoo mang gen AvrXa27 (là một Avr thuộc họ AvrBs3 của vi khuẩn). AvrXa27 tương tác vớí vùng promotor của gen Xa27, kích hoạt sự biểu hiện của gen này và dẫn tới tính kháng.

Câu 25: Mức độ đa dạng của quần thể vi khuẩn Xoo tại châu Á và Việt Nam. Đặc điểm và vai trò của các giống dòng chỉ thị đẳng gen đối với Xoo?

Vi khuẩn Xoo có tính đa dạng cao. Tới nay (2007), khoảng 30 race vi khuẩn đã được công bố từ nhiều nước trên thế giới dựa vào đặc tính gây bệnh trên các bộ giống chỉ thị hoặc dựa vào các nghiên cứu phân tử. Tuy nhiên, vì được đánh giá độc lập nên các race từ các nước không giống nhau (mặc dù có thể chung ký hiệu). Ví dụ các isolates Philippin được chia thành 10 race (ký hiệu là race 1, 2....10) còn các isolates của Trung Quốc được chia thành 9 races (cũng ký hiệu là race 1, 3, 3....9) và các race của Trung Quốc không tương ứng với các race của Philippin. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, mặc dù có sự di chuyển của vi khuẩn từ vùng này sang vùng khác nhưng nhìn chung có sự khác nhau giữa quần thể Xoo của các nước. Điều này dẫn tới việc nghiên cứu mức độ đa dạng của mỗi nước/vùng sinh thái là cần thiết trước khi thực hiện các chương trình chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá.

Đa dạng của Xoo tại Việt Nam:

Nghiên cứu hợp tác giữa trường ĐHNNI và ĐH Kyushu Nhật Bản trong giai đoạn 2001-2005 dựa trên phản ứng kháng nhiễm đối với 11 dòng đẳng gen mang gen kháng đơn (dòng số 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 12, 13, bảng trên) cho thấy quần thể Xoo ở các tỉnh phía bắc Việt Nam khá đa dạng gồm 12 race (chú ý, một số nước dùng bộ dòng đẳng gen tương tự cũng phát hiện thấy mức đa dạng khá lớn; chẳng hạn ở Nepal là 26 races; Srilanka là 14).

Các race chiếm ưu thế tại miền Bắc Việt Nam, theo thứ tự, là các race 5 (gen kháng: xa5, Xa7 và Xa21), race 3 (gen kháng: Xa4, xa5, Xa7 và Xa21) và race 2 (gen kháng: Xa4, xa5, Xa7, Xa14 và Xa21).

Đặc điểm và vai trò của các giống dòng chỉ thị đẳng gen đối với Xoo:

Các bộ giống chỉ thị hiện nay đang sử dụng phổ biến gồm các giống/dòng gần đẳng gen (near isogenic lines) chứa một gen kháng (single gene) hoặc vài gen (pyramid line). Tuy nhiên vì các dòng đa gen (pyramid) thường biểu hiện tính kháng với hầu hết các chủng nên ít có giá trị trong phân biệt các chủng.

Các giống/dòng chỉ thị đẳng gen chỉ chứa một gen kháng duy nhất đối với các chủng của Xoo. việc sử dụng các giống/dòng chỉ thị đẳng gen thường có ý nghĩa lớn trong việc phân biệt các chủng khác nhau à giúp xác định được mức độ đa dạng của từng vùng sinh thái à tạo điều kiện thuận lợi trong các chương trình chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá.

Câu 26 : Đặc điểm sự tái sinh và tính kháng đối với begomovirus?

Tái sinh (sinh sản) của begomovirus

            Begomovirus, giống như các geminivirus khác, tái sinh theo cơ chế vòng lăn (rolling circular mechanism). Cơ chế vòng lăn có thể được chia làm 2 pha và được thực hiện trong nhân tế bào ký chủ.

            Pha tổng hợp sợi DNA vòng đơn (bộ gien có mặt trong phân tử virus) thành sợi DNA vòng kép khi bộ gien virus được chuyển vào nhân tế bào. Như vậy sợi kép sẽ gồm một sợi virus và một sợi tương đồng virus. Pha này vẫn chưa được hiểu rõ.

            Pha tái sinh theo cơ chế vòng lăn: Protein Rep (sau khi được tổng hợp) sẽ cắt sợi virus tại chuỗi bảo toàn TATATTAC. Nhờ vật liệu cũng như enzyme DNA polymearase của tế bào, sợi virus được tổng hợp liên tục trên sợi tương đồng virus. Protein Rep lại tiếp tục cắt sợi virus mới được tổng hợp tại chuỗi TATATTAC (cũng vừa mới được tổng hơp) thành một sợi virus hoàn chỉnh dưới dạng sợi đơn mạch thẳng. Protein Rep sau đó sẽ nối 2 đầu của mạch thẳng để tạo ra bộ gien virus sợi đơn mạch vòng hoàn chỉnh.

Tính kháng đối với begomovirus

            Tính kháng của begomovirus thông qua gen kháng

Cho tới nay, người ta chưa phát hiện thấy gen kháng R chống lại begomovirus trên cây cà chua trồng (Lycopersicon esculentum). Tuy nhiên một số gen kháng chống lại begomovirus đã được phát hiện thấy trên một số giống cà chua dại. Ví dụ Ty1 gen được phân lập từ cây cà chua dại (Lycopersicon chilense) và là một gen kháng trội không hoàn toàn. Ty-1 dường như tương tác với các protein chịu trách nhiệm di chuyển của virus để tạo tính kháng. Ty-1 đã được chuyển vào cà chua trồng để tạo giống kháng.

            RNA silencing và begomovirus

RNA silencing là cơ chế quan trọng của cây (cũng như của nấm, động vật) nhằm điều hòa biểu hiện gen và chống sự xâm nhiễm virus. Cây có một số đường hướng silencing, trong đó quan trọng nhất là đường hướng RNA silencing thông qua siRNA. Đây là đường hướng xảy ra ở tế bào chất và trong trường hợp chống sự xâm nhiễm virus sẽ gồm các bước chính sau:

Hình thành các dsRNA trong tế bào chất. Các virus RNA thực vật trong quá trình tái sinh sẽ hình thành các sản phẩm trung gian là dsRNA. Các begomovirus, do các gen mã hóa theo 2 chiều ngược nhau dẫn sản phẩm phiên mã của chúng (các transcripts) sẽ gối lên nhau và tương đồng ở đầu 3'. Phần tương đồng gối lên nhau này sẽ bắt cặp để tạo đoạn dsRNA.

3        Các protein Dicer (là một endonuclease thuộc RNAse nhóm 3, chịu trách nhiệm cắt các phân tử RNA sợi kép) của tế bào ký chủ sẽ cắt đoạn dsRNA thành các phân tử dsRNA nhỏ có kích thước 21-22 nts gọi là các siRNA.

Các phân tử siRNA sợi kép tách thành các phân tử siRNA sợi đơn và kết hợp với các phân tử protein của tế bào tạo thành phức hợp RISC (RNA Induced Silencing Complex), trong đó chứa một RNA endonuclease là Argonaute (ký hiệu là AGO).

RISC sẽ nhận biết được các phân tử RNA virus trong tế bào chất và tương đồng với siRNA. Đoạn siRNA sợi đơn sẽ bắt cặp đặc hiệu với phần tương đồng trên phân tử RNA virus và AGO của RISC sẽ cắt phân tử RNA virus. 

RNA silencing là một cơ chế của cây chống lại virus thì virus cũng có cơ chế để chống lại sự silencing của cây. Người ta đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng C4 (hay AC4) của begomovirrus có thể ức chế đường hướng RNA silencing của cây ký chủ trong tế bào chất.

Câu 27 : Vai trò của tính kháng ngang và tính kháng dọc trong chọn tạo giống kháng bệnh?

· Tính kháng dọc

Tính kháng dọc thường do một hoặc một vài gen qui định nên còn được gọi là tính kháng đơn gen. Các gen này điều khiển các bước/sự kiện quan trọng trong quá trình phát triển bệnh do đó còn được gọi là các gen kháng chủ. Chỉ cần một hoặc một vài gen kháng chủ đã có thể tạo ra tính kháng. Tính kháng dọc mang tính đặc hiệu cao, nhằm vào một hoặc một số chủng tác nhân gây bệnh chỉ có thể chống được các chủng tương thích của tác nhân gây bệnh (nên còn được gọi là tính kháng đặc hiệu chủng). Di truyền tính kháng dọc tuân theo qui luật di truyền Mendel và quan hệ giữa gen ký chủ qui định tính kháng dọc và gen tương ứng của ký sinh là quan hệ gen-for-gen.

Cây mang tính kháng dọc nhìn chung kháng hoàn toàn tác nhân gây bệnh. Hơn nữa tính kháng dọc dễ thao tác hơn (phân lập, chuyển gen, đánh giá) trong các chương trình nhân giống nên thường được ưa thích hơn.

Tính kháng dọc, mặc dù rất hiệu quả chống lại các chủng tương ứng của tác nhân gây bệnh nhưng nhìn chung không bền vững. Tính kháng có thể bị mất nếu xuất hiện trong quần thể tác nhân gây bệnh các chủng mới không tương thích (từ nơi khác tới hoặc chủng bị kháng đột biến) có khả năng gây bệnh (xem thêm phần đồng tiến hóa R-Avr chương 4).

Tính kháng dọc, do vậy, có hiệu quả nhất khi:

4        Được tổng hợp vào cây hàng năm dễ nhân giống như cây cốc hạt nhỏ (lúa mỳ, lúa...).

5        Nhằm chống các loại tác nhân gây bệnh không sinh sản hoặc phát tán nhanh như nấm Fusarium, hoặc không đột biến nhanh như nấm Puccinia

6        Bao gồm các gen kháng chủ đủ "mạnh" để bảo vệ hoàn toàn và lâu dài cây ký chủ.

7        Quần thể ký chủ không chỉ gồm 1 giống đồng nhất về di truyền được trồng trên một vùng rộng lớn.

Nếu một hoặc nhiều điều kiện trên không đáp ứng được thì tính kháng dọc sẽ nhanh chóng bị phá vỡ. Ngoài ra, tính kháng dọc, vì mức độ kháng rất cao nên cũng tạo áp lực chọn lọc lớn lên quần thể tác nhân gây bệnh dẫn tới dễ hình thành các chủng tác nhân gây bệnh mới.

Vì tính kháng dọc dễ bị bẻ gẫy bởi một chủng tác nhân gây bệnh độc mới hình thành nên nhiều chiến lược đã được áp dụng để khắc phục nhược điểm này chẳng hạn như hỗn hợp giống hoặc tạo giống mang nhiều gen kháng chủ.

Hỗn hợp giống (cultivar mixture). 

Trong trồng trọt, người ta có thể làm giảm sự phát triển của dịch bệnh bằng cách tạo ra sự đa dạng di truyền của một loài cây trồng. Phương pháp đơn giản nhất để tạo ra sự đa dạng này là hỗn hợp giống (cultivar mixture). Hỗn hợp giống là hỗn hợp các giống giống nhau về các đặc trưng nông học như thời gian sinh trưởng, phát triển, chất lượng và hình dạng hạt...nhưng khác nhau về gen kháng.

Hỗn hợp giống không chống hoàn toàn được bệnh nhưng làm giảm đáng kể tốc độ phát triển bệnh nhờ 4 cơ chế:

(i) Khoảng cách giữa các cây mẫn cảm tăng dẫn tới giảm tốc độ phát tán.

(ii) Tương tự, tạo ra rào cản vật lý là các cây của giống có tính kháng cao.

(iii) Tạo tính kháng tạo được do chủng không độc gây ra.

(iv) Thay đổi vi khí hậu theo hướng bất lợi cho bệnh. Vd. trong một thí nghiệm hỗn hợp giống giữa 1 lúa nếp (mẫn cảm với nấm đạo ôn, có chiều cao cao hơn 35-40 cm ) 1 giống lúa tẻ, số ngày với ẩm độ 100% vào 8 giờ sáng trên ruộng thí nghiệm đã giảm từ 20 ngày xuống còn khoảng 2 ngày và diện tích lá lúa nếp bị phủ sương đã giảm từ 84% xuống 36% (Zhu et al. 2005). Kết quả TLB trên giống lúa nếp đã giảm 90%.

Hỗn hợp giống đặc biệt có ý nghĩa đối với các bệnh hại phần trên mặt đất đa chu kỳ. Ví dụ: tại TQ, đến năm 2000, >3000 ha lúa tại tỉnh Vân Nam áp dụng phương pháp hỗn hợp giống để chống bệnh đạo ôn, TLB giảm 1 - 20 % .

5        Tổng hợp nhiều gen kháng trong một giống. Người ta có thể lai các giống mang các gen kháng khác nhau để tạo ra giống chứa nhiều gen kháng. Thông thường tính kháng của các giống mang nhiều gen kháng chủ thường khá bền vững vì tác nhân gây bệnh không dễ đột biến đồng thời để bẻ gẫy nhiều gen kháng. Tuy nhiên, việc tạo giống mang nhiều gen kháng rất phức tạp.

·  Tính kháng ngang

Tính kháng ngang thường do nhiều gen qui định (nên còn được gọi là tính kháng đa gen), mỗi gen đóng góp một mức độ nhỏ vào tính kháng (nên còn được gọi là tính kháng gen thứ). Tính kháng ngang di truyền theo qui luật di truyền số lượng (nên còn được gọi là tính kháng số lượng).

Tính kháng ngang qui đinh tính kháng không hoàn toàn nhưng bền vững. Tính kháng ngang không bị bẻ gẫy nhanh và bất thình lình như tính kháng dọc. Tính kháng ngang liên quan đến nhiều quá trình dẫn tới phản ứng phòng thủ. Tính kháng ngang có mặt khắp nơi, trên cả cây trồng lẫn cây dại, chống tất cả các chủng của tác nhân gây bệnh kể cả những chủng độc nhất (nên còn được gọi là tính kháng không đặc hiệu).

3        Tính kháng ngang (tính kháng cơ bản) nhìn chung có mức độ kháng thấp và do đó tạo áp lực chọn lọc thấp lên quần thể tác nhân gây bệnh.

·   Có thể tóm tắt tính kháng dọc và ngang ở bảng sau

Chỉ tiêu

Giống kháng dọc

Giống kháng ngang

1.Số lượng gen kháng

1 vài gen kháng (đơn gen)

Nhiều gen kháng(đa gen)

2.Tính (chọn lọc) chuyên tính của gen kháng

Rất chuyên tính

Không chuyên tính

3.Mức độ kháng

Cao

Thấp

4.Tính ổn định

Không bền vững )

Bền vững

5. Kháng đối với thành phần chủng trong quần thể ký sinh

ít chủng

Hầu hết các chủng trong quần thể ký sinh

6.Tác động của gen kháng vào quần thể ký sinh  (áp lực chọn lọc)

Thúc đẩy sự phát sinh hình thành các nòi, race mới (chủng có độc tính cao hơn)

Không thúc đẩy sự phát sinh hình thành các nòi race mới (quần thể ký sinh ổn định lâu dài)

8.Phản ứng tự vệ

Thường là phản ứng siêu nhạy

Các phản ứng khác nhau

9.Di truyền

Theo quy luạt di truyền Mendel, phần lớn di truyền tính trội

Theo di truyền số lượng

10. Ảnh hưởng của ngoại cảnh

Ít bị ảnh hưởng

Dễ bị ảnh hưởng

Câu 28 (hic câu cuối cùng đây chết mất, mệt quá cơ): Nguồn gen kháng bệnh? Ví dụ về nguồn gen kháng bệnh đạo ôn, bạc lá và begomovirus?

Nguồn gen kháng bệnh có chung "bể gen" như đối với các gen qui định các tính trạng di truyền khác. "Bể gen" này có thể là các giống địa phương hiện trồng, giống nhập nội, giống địa phương cổ truyền, giống đã bị loại bỏ, các loài cây họ hàng hoang dại và cả các giống được gây đột biến nhân tạo.

 Thông thường, gen kháng bệnh có thể tìm thấy trên các cây sống sót tại nơi có áp lực bệnh cao hoặc nơi có bệnh nặng. Trong trường hợp không thể tìm thấy cây sống sót tại một nơi có bệnh nặng thì gen kháng có thể tìm ở loài cây tương ứng trồng ở nơi khác hoặc tìm trên họ hàng hoang dại. Một khả năng nữa để tìm nguồn gen kháng là tìm trên cây tại trung tâm khởi nguyên của tác nhân gây bệnh vì nếu cây đã tồn tại lâu dài cùng với sự có mặt của bệnh thì chứng tỏ chúng phải mang gen kháng. Tương tự nguồn gen kháng cũng có thể tìm thấy tại trung tâm khởi nguyên của cây.

Thuyết Vavilop về đồng tiến hóa ký sinh - ký chủ

10    Vùng khởi nguyên xuất sứ của một loài cây trồng là trung tâm hình thành phong phú nhất các loại, dạng, giống của loài cây trồng đó và cây dại. Nhưng ở đó cũng là trung tâm hình thành đầy đủ nhất các loài, dạng, chủng, nòi của ký sinh nhờ có quá trình tiến hoá và chọn lọc tự nhiên giữa ký sinh và ký chủ đã diễn ra ở đây lâu đời nhất.

Tính đa dạng cây trồng và ký sinh ở vùng này thể hiện qua quá trình biến dị mạnh mẽ nhất, nhờ đó xuất hiện và tích luỹ nhiều giống có tính kháng cao và đồng thời xuất hiện và tích luỹ nhiều chủng ký sinh có tính độc cao.

Quan hệ ký sinh và ký chủ đó cũng luôn biến động song cũng đảm bảo thế cân bằng bền giữa ký sinh và ký chủ tạo thuận lợi cho sự phát triển của cả 2 phía. Phía cây trồng có các đặc tính chống bệnh mới, đồng thời tạo cho ký sinh có độc tính mới để vượt qua tính kháng của cây trồng đó.

Trong mối quan hệ đồng tiến hoá đó thì tiến hoá khởi đầu chỉ thấy ở các loài cây ký chủ sau đó mới xuất hiện chủng ký sinh có tính độc mới để cùng tồn tại. Vậy chúng ta cần tìm kiếm nguồn gen kháng ở loài cây, giống cây ở vùng địa lý, xuất sứ khởi nguyên của chúng trên thế giới. Nguồn gen kháng đó là nguồn vật liệu nguyên thuỷ có triển vọng nhất trong lai tạo chọn lọc giống có tính miễn dịch và kháng sâu bệnh.

Việc lựa chọn gen kháng hoặc yếu tố kháng căn cứ vào nhiều yếu tố, quan trọng nhất là mức độ đa dạng của quần thể tác nhân gây bệnh, đặc tính gây bệnh và tính độc của quần thể tác nhân gây bệnh đặc biệt là của các chủng, nòi chiếm ưu thế. Ngoài ra các gen được lựa chọn nên có khả năng kháng phổ rộng.

Ví dụ 1. Đối với bệnh đạo ôn ở miền Bắc Việt Nam, các gen kháng Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-ta2, Pi-k nên được sử dụng để tạo giống kháng nấm đạo ôn.

Ví dụ 2. Đối với bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam, vì các race 5, 3 và 2 chiếm ưu thế trong quần thể vi khuẩn bạc lá nên các gen kháng xa5, Xa7 và Xa21 nên được sử dụng.

6        Ví dụ 3. Đối với bệnh xoăn vàng lá cà chua do begomovirus, trong trường hợp sử dụng kỹ thuật kháng dựa vào RNA silencing, người ta nên chọn các vùng gen hoặc gen bảo thủ cho cả chi begomovirus, chẳng hạn như đầu C của gen CP hoặc đầu N của gen Rep để tạo các cấu trúc RNA silencing chuyển vào cây cà chua.