PHẦN 1

 ĐẶT VẤN ĐỀ

Nước ta có diện tích lãnh thổ rộng 331.689 km2, nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ trung bình năm 230C. Với bờ biển dài 3.260 km, nhiều đầm, phá, các bãi triều, các vũng, vịnh ven biển…rất thuận lợi để phát triển nuôi trồng thủy sản biển và nuôi nước lợ. Diện tích vùng triều có khả năng phát triển nuôi trồng thủy sản 1.130.000 ha, diện tích các eo vịnh khoảng 500.000 – 700.000 ha. Đây là vùng nuôi trồng thủy sản rộng lớn, góp phần quan trọng phát triển kinh tế thủy sản. [28]

Sản lượng nội địa tăng trung bình 16,1%/năm [29]. Nếu như năm 1970, tốc độ tăng trưởng hằng năm về thủy sản là 3,9% thì năm 2006 tốc độ tăng trưởng là 36% [12]. Nuôi trồng thủy sản đã góp phần quan trọng trong chuyển dịch cơ cấu kinh tế, đảm bảo an toàn thực phẩm, tạo công ăn việc làm, xóa đói giảm nghèo và góp phần đưa ngành thủy sản thực sự trở thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của nước ta.

So với nghề nuôi nước ngọt thì nuôi thủy sản nước lợ và mặn còn rất mới. Song năng suất và sản lượng nuôi lợ và mặn mang lại rất lớn, hiệu quả và lợi nhuận cho người nuôi tương đối cao. Sản lượng của nghề nuôi lợ và mặn giữ vai trò quan trọng trong thị trường xuất khẩu và thị trường nội địa. Nghề nuôi thủy sản nước lợ và mặn nói riêng và thủy sản nói chung phát triển góp phần giải quyết việc làm, tăng thu nhập cho nông ngư dân cũng đồng thời chế được việc khai thác quá mức khu vực ven bờ, bảo vệ nguồn tài nguyên biển. 

Cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch, 1970) là đối tượng nuôi có giá trị kinh tế cao. Nghề nuôi cá chẽm được hình thành từ thập kỷ 70 ở Songkla – Thái Lan và được nhân rộng ra các nước Châu Á như: Trung Quốc, Đài Loan, Singapore, Malaysia, Indonesia…đóng góp không nhỏ vào sản lượng cá biển Thế giới. Theo thống kê của FAO năm 2006 tổng sản lượng cá chẽm nuôi thế giới tăng 34,7% so với năm 1990 [12].

Ở Việt Nam nói chung và Thừa Thiên Huế nói riêng trong những năm trở lại đây nghề nuôi cá chẽm cũng bắt đầu phát triển. Song song với sự phát triển củanghề nuôi cá chẽm là sự gia tăng về dịch bệnh như bệnh vi khuẩn, vius, nấm, ký sinh trùng…trong đó bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá chẽm đã gây tác hại rất lớn cho cá nuôi, nhất là giai đoạn cá giống ảnh hưởng không nhỏ đến kinh tế của người dân. Mặt khác việc sử dụng hoá chất, thuốc kháng sinh để điều trị không đem lại hiệu quả mong muốn do hiện tượng kháng thuốc và tồn dư kháng sinh trong sản phẩm gây mất an toàn vệ sinh cho người tiêu dùng [16], [17], [27]. Vì vậy việc phòng trị bệnh do vi khuẩn gây ra bằng thảo dược thay thế kháng sinh đang là một giải pháp có biên độ an toàn cao giúp sản phẩm thủy sản đứng vững hơn trên thị trường [3].

Xuất phát từ những vấn đề trên, được sự đồng ý của khoa Thủy sản, bộ môn Ngư Y và giáo viên hướng dẫn, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu tác dụng của Bokashi trầu lên sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh trên cá chẽm giống (Lates calcarifer, Bloch, 1790) nuôi tại Thừa Thiên Huế”

Mục tiêu nghiên cứu:

            - Làm quen với công tác nghiên cứu khoa học

- Xác định vi khuẩn gây bệnh trên cá chẽm giống (Lates calcarifer)

- Nghiên cứu tác dụng của Bokashi trầu lên sự phát triển của vi khuẩn phân lập được.

PHẦN 2

 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

2.1. Đặc điểm sinh học cá chẽm [5]

2.1.1. Hệ thống phân loại

Theo Nguyễn Nhật Thi (1991) ở Việt Nam có duy nhất một loài trong họ cá chẽm đó là Lates calcarifer. Tên thường gọi là cá chẽm hay cá vược.

Năm 1974, FAO công nhận hệ thống phân loại cá chẽm như sau:

Ngành động vật có dây sống:    Chordata

Lớp cá xương:                        Osteichthyes

                      Bộ cá vược:                          Percifomes

                           Họ cá sơn biển:                  Serranidae

                                     Giống cá chẽm:              Lates

                                        Loài:                            Lates calcarifer, Bloch, 1790

2.1.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo

Cá chẽm có thân hình thon dài và dẹp bên, cuống đuôi khuyết sâu. Đầu nhọn, nhìn bên cho thấy phía trên hơi lõm xuống ở giữa và hơi lồi ở lưng. Miệng rộng và hơi so le, hàm trên kéo dài đến phía dưới sau hốc mắt. Răng dạng nhung, không có răng nanh, trên nắp mang có gai cứng, vây lưng gồm có 2 vi: Vi trước có 7 – 9 gai cứng và vi sau có 10 – 11 tia mềm. Vi hậu môn có 3 gai cứng, vi đuôi tròn và có hình quạt. Vẩy dạng lược và có kích cỡ vừa phải, có 61 vẩy đường bên.

Khi cá còn khoẻ, trên mặt lưng có màu nâu, mặt bên và bụng có màu bạc khi sống trong môi trường nước biển, màu nâu vàng khi sống trong môi trường nước ngọt. Khi cá ở giai đoạn trưởng thành sẽ có màu xanh lục hay vàng nhạt trên lưng và màu vàng bạc ở mặt bụng.

2.1.3. Đặc điểm phân bố

Theo Mai Đình Yên (1979) ở Việt Nam cá chẽm phân bố dọc theo các vùng nước lợ, nước mặn ven biển từ Móng Cái đến mũi Cà Mau và ở những thủy vực nước ngọt có dòng chảy thông ra biển.

Theo Greenwood (1976) và Moore (1980) cá chẽm phân bố tự nhiên ở ven biển thuộc vùng Ấn Độ Dương và Tây Thái Bình Dương bao gồm các nước như: India, Burma, Srilanka, Bangladesh, Malaysia, Peninsula, Java, Borneo…[23]

Theo FAO, Cá chẽm là loài phân bố rộng từ vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới thuộc Tây Thái Bình Dương và Ấn Độ Dương, giữa kinh tuyến 500 Đông và 1600 Tây, vĩ tuyến 260 Bắc và 250 Nam [23]. Dưới đây là một số quốc gia sản xuất cá chẽm (hình 2.2):

            Cá chẽm rất rộng muối và có tính di cư xuôi dòng, cá lớn lên chủ yếu ở vùng nước ngọt như sông, hồ. Khi thành thục (3 – 4 năm tuổi ), chúng sẽ di cư ra vùng cửa sông, ven biển có độ mặn thích hợp từ 30  – 32‰ để sinh sản. Ấu trùng sau khi nở ra sẽ đưa vào vùng cửa sông, ven bờ và lớn lên, cá con sẽ dần dần di cư vào các thủy vực nước ngọt sinh sống và phát triển thành cá thể trưởng thành.

2.1.4. Đặc điểm sinh trưởng

Sinh trưởng của cá chẽm có dạng đường cong sigma. Trong đó cá tăng trưởng chậm ở giai đoạn đầu nhưng tăng trưởng nhanh khi cá đạt kích cỡ 20 – 30 gam và giảm dần khi cá đạt trọng lượng khoảng 4 kg (Kungvankij, 1986). Môi trường sống khác nhau cũng ảnh hưởng tới tốc độ sinh trưởng của cá. Cá sống trong môi trường nước ngọt có tốc độ tăng trưởng nhanh hơn trong môi trường nước mặn (Wantanabe et al, 1984). Cá chẽm có chiều dài và trọng lượng tối đa là 2 m và 50 kg (Bahanal và Soseanto, 1982).

2.1.5. Đặc điểm dinh dưỡng

Cá chẽm là loài cá rất dữ. Khi cá còn nhỏ, tuy chúng có thể ăn các loài phiêu sinh thực vật (20% trọng lượng thức ăn) mà chủ yếu là tảo khuê, nhưng thức ăn chủ yếu vẫn là cá, tôm nhỏ (80%). Khi cá lớn hơn 20 cm, 100% thức ăn là động vật bao gồm giáp xác khoảng 70% và cá nhỏ 30%. Cá chẽm bắt mồi rất dữ và có thể bắt cả mồi có kích cỡ bằng cơ thể của chúng. Cá chẽm chỉ bắt mồi sống và di động.

Theo Chacko, 1958 thức ăn chủ yếu của cá chẽm là các loại cá đối, cá măng và bọn giáp xác như: cua, tôm, ngoài ra chúng còn ăn các động vật thân mềm hai mảnh vỏ như: sò, vẹm, ngao,....Tame và Marychamys (1986) cho rằng: ấu trùng cá chẽm ăn sinh vật phù du rồi chuyển sang ăn ấu trùng côn trùng. Ở giai đoạn cá bột ăn các động vật nổi như: copepoda, ấu trùng nhuyễn thể....Khi cá đạt cỡ 5 – 15 cm thì thức ăn chủ yếu của chúng là tôm và cá, giai đoạn này thể hiện tính ăn lẫn nhau. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Jena và Patnaik (1976), Russell và Greett (1985).

Cá chẽm có tập tính săn mồi. Cá con 10 – 40 mm có thể sử dụng thức ăn bất kỳ lúc nào trong ngày nhưng mạnh nhất vào lúc xế chiều (Barlow et al. 1995).

Lương Công Trung (1999), nghiên cứu sinh sản nhân tạo cá chẽm từ cá bố mẹđược bắt ngoài tự nhiên và thấy rằng cá chẽm bắt mồi mạnh vào lúc trời tối từ 17 giờ trởđi. Cá bắt mồi ngay khi cho ăn thức ăn xuống và ăn rất nhanh (80 – 100%). Cá mới được thuần dưỡng chưa quen với môi trường mới chúng thường tránh xa khi có tiếng động hoặc bóng người.

Cá chẽm sẽ ăn thịt đồng loại với những con cá có chiều dài lên đến xấp xỉ 67% chiều dài của con cá lớn. Tính ăn thịt đồng loại chủ yếu ở những con cá có chiều dài nhỏ hơn 15 cm. Những con cá có chiều dài nhỏ hơn 16 mm rất khó khăn trong việc tập cho chúng ăn thức ăn chế biến.

2.1.6. Đặc điểm sinh sản

Đặc điểm nổi bật trong việc sinh sản của cá chẽm là có sự chuyển đổi giới tính từ cá đực thành cá cái sau khi tham gia lần sinh sản đầu tiên và đây được gọi là cá chẽm thứ cấp. Tuy nhiên, cũng có những cá cái được phát triển trực tiếp từ trứng và được gọi là cá cái sơ cấp. Chính vì thế trong thời gian đầu (1,5 –  2 kg) phần lớn là cá đực, nhưng khi cá đạt 4 – 6 kg, phần lớn là cá cái.

Thông thường, rất khó phân biệt giới tính ngoại trừ vào mùa sinh sản, có thể dựa vào đặc điểm sau:

- Cá đực có mõm hơi cong, cá cái thì thẳng

- Cá đực có thân thon dài hơn cá cái

- Cùng tuổi, cá cái sẽ có kích cỡ lớn hơn cá đực

- Trong mùa sinh sản, những vẩy gần lỗ huyệt của cá đực sẽ dày hơn cá cái

- Bụng của cá cái to hơn cá đực vào mùa sinh sản.

Cá thành thục (3 – 4 năm tuổi) có tập tính di cư và sinh sản vào chu kỳ trăng, lúc trăng tròn hay trăng non vào buổi tối khi triều lên. Cá đẻ quanh năm nhưng tập trung vào tháng 4 – 8. Trước khi đẻ, cá có tập tính tách đàn và ngừng ăn 1 tuần, cá đực và cá cái bơi lội gần nhau thường xuyên trên tầng mặt khi cá sắp đẻ, cá đẻ nhiều đợt trong vòng 7 ngày, cá có trọng lượng 5,5 – 11 kg có thể đẻ 2,1 – 7,1 triệu trứng. Trong điều kiện nhiệt độ 28 – 320C, độ mặn 30 – 32‰, trứng nở trong vòng 17 –  18 giờ, ấu trùng mới nở có chiều dài khoảng 1,5 mm, có túi noãn hoàng 0,86 mm và giọt dầu nằm ở phía trước. Khi nước đứng im, cá dựng đứng thân trong nước, đầu hướng lên khi lội, ấu trùng làm thành góc 45 – 900 so với mặt phẳng ngang. Cơ thể thon, dẹp, sắc tố hình thành từng điểm rải rác không đều trên thân, mắt, hệ thống tiêu hóa có thể nhìn thấy rõ ràng. Khi cá đạt 3 ngày tuổi, miệng bắt đầu xuất hiện. Ấu trùng tiêu hết noãn hoàng ở ngày thứ 4.

2.1.7. Chu kỳ phát triển

Sơ đồ 2.1. Chu kỳ phát triển của cá chẽm (Lates calcarifer) [26]

Cá chẽm trải qua phần lớn thời gian sinh trưởng (2 – 3 năm) trong các thủy vực nước ngọt như: sông, hồ nối liền với biển. Cá đạt tốc độ tăng trưởng nhanh thường đạt cỡ 3 – 5 kg sau 2 – 3 năm. Cá trưởng thành 3 – 4 tuổi di cư từ vùng nước ngọt về cửa sông và ra biển nơi có độ mặn 30 - 32‰ để phát triển tuyến sinh dục và đẻ trứng sau đó.

Vòng đời cá chẽm ở phía Bắc Australia cũng được nhiều tác giả nghiên cứu như Moore (1978, 1980, 1982), Moore và Reynolds (1982), Russell và Grrett (1983, 1985), Griffin (1985, 1986), Davis (1982, 1985) đều có nhận định vòng đời của cá chẽm ở phía Bắc Australia giống với vòng đời cá chẽm ở Thái Lan và đưa ra vòng đời cá chẽm (sơ đồ 2.1):

Smith (1965) ghi rằng, một số con cá có vòng đời trong nước ngọt nơi chúng lớn lên cỡ 65 cm và trọng lượng đạt 19,5 kg. Tuyến sinh dục của những con cá đó thì không phát triển. Trong môi trường nước lợ, cá chẽm đạt 1,7 m được tìm thấy ở vùng Indonesia. Hiện nay điều chưa biết là cá trưởng thành có di cư ngược dòng không hay chúng giữ giai đoạn còn lại của chúng với đời sống ở biển.

2.1.8. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của cá chẽm

     Nhiệt độ

Nhìn chung cá chẽm tăng trưởng chậm khi nhiệt độ nước xuống dưới 250C, giảm khả năng bắt mồi dưới 200C và tỷ lệ sống thấp dưới 150C. Trong nghề nuôi cá chẽm người ta thường mong muốn và duy trì nhiệt độ nước trong khoảng 26 – 300C.

     Độ mặn

Cá chẽm có khả năng chịu đựng được khoảng dao động của độ mặn khá  rộng từ 0 – 36‰. Thậm chí cá chẽm nhỏ 10 cm có thể di cư từ vùng nước mặn tới vùng nước ngọt trong khoảng thời gian 6 giờ mà không bị chết (Rasmsussen, 1911). Trong ao nuôi cá thương phẩm ngưỡng độ mặn phải đạt từ 27 – 33‰.

     Oxy hòa tan

Khi hàm lượng oxy hòa tan trong nước giảm xuống còn 2 ppm sẽ làm cho cá bị chết chỉ trong một vài phút. Trừ khi hàm lượng oxy tăng trở lại nhanh chóng ngay sau đó . hàm lượng oxy thích hợp cho cá phát triển từ 4 – 6 ppm.

2.2. Tình hình nghiên cứu dịch bệnh trên thế giới và Việt Nam

2.2.1. Trên thế giới

Nhiều công trình nghiên cứu về dịch bệnh trên động vật thủy sản nhằm ngăn chặn những tổn thất do dịch bệnh gây ra. Tuy nhiên, so với các lĩnh vực khác như y học, thú y thì bệnh cá là một lĩnh vực còn non trẻ, nó chỉ thực sự được quan tâm khi ngành nuôi trồng thủy sản phát triển mạnh.

Cuối thế kỷ XIX,  một số tác giả đã xuất bản cuốn sách hướng dẫn dịch bệnh cá nhưng cơ bản chỉ mô tả các triệu chứng lâm sàng là chủ yếu. Sang đầu thể kỷ XX các nhà khoa học thế giới đã bắt đầu nghiên cứu và viết cuốn sách hướng dẫn về  bệnh cá. Bắt đầu từ thời gian này trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh thủy sản.

Vào năm 1904, nhà nghiên cứu bệnh học người ĐứcBruno Hofer đã viết cuốn sách “Tác nhân gây bệnh ở cá” trong đó mô tả một số tác nhân gây bệnh trên cá nước ngọt mà chủ yếu là tác nhân vi khuẩn. Năm 1929, V.A.Dogiel viết cuốn sách “Bệnh vi khuẩn cá” và đến năm 1939 đã đưa ra phương pháp cơ bản nghiên cứu vi khuẩn trên cá nước ngọt. Do đó, công tác nghiên cứu bệnh thủy sản ngày càng phát triển, nhiều nhà khoa học trên thế giới như: E.M.Lyaiman (Liên Xô, 1949), Mysselius Gussev (Liên Xô), Shaperclaus (Đức), Ymaguti (Nhật), Hoffman (Mỹ)…đã có nhiều công trình nghiên cứu bệnh cá trên các phương diện: tác nhân gây bệnh, dấu hiệu bệnh lý, cách phòng trị…được ứng dụng vào thực tế sản xuất (Bùi Quang Tề, 1998).

Từ 1970 đến những năm cuối thế kỷ XX, ngành nuôi trồng thủy sản của thế giới đã phát triển mạnh không chỉ nuôi cá nước ngọt mà nhiều loài cá biển, giáp xác, động vật thân mềm có giá trị kinh tế được đưa vào nuôi. Nên thời kỳ này, ngoài việc nghiên cứu về ký sinh trùng các bệnh truyền nhiễm do virus, nấm hàng loạt công trình nghiên cứu về vi khuẩn gây ra trên cá, tôm, cua, động vật thân  mềm…đã được nghiên cứu. Các tác giả Plumb.J.A (1997), Ausstin D.A (1999) đã nghiên cứu và công bố hàng trăm loài vi khuẩn khác nhau gây bệnh trên động vật thủy sản. Trong đó tập trung chủ yếu một số giống như: Vibrio ssp, Aeromonas spp, Pseudomonas spp, Mycobacterium spp, Myxobacteria spp…

2.2.2. Ở Việt Nam

Vấn đề nghiên cứu bệnh thủy sản ở nước ta chậm hơn so với các nước trên thế giới và được bắt đầu từ năm 1960 trở lại đây. Hà Ký là người đầu tiên phát hiện được 120 loài ký sinh trùng gây bệnh trong đó có 42 loài mới đối với khoa học và ông cũng đã hoàn thiện phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng của Dogiel trong điều kiện Việt Nam.

Đặc biệt từ năm 1980, đã có hàng loạt công trình nghiên cứu về tác nhân virus, vi khuẩn, nấm…được công bố, các công trình này thúc đẩy nghề nuôi cá ngày càng phát triển và đi vào ổn định.

Giai đoạn từ năm 1985 đến nay, các nhà khoa học Việt Nam chủ yếu nghiên cứu về bệnh tôm, về hội chứng lở loét ở cá. Việc nghiên cứu về vi khuẩn, virus và  nấm còn rất hạn chế. Hiện nay chúng ta đang tập trung nghiên cứu để sản xuất vacxin trong nghề nuôi trồng thủy sản [14].

Một đề tài cấp Nhà nước mang mã số KN 04 – 12 từ 1991 – 1995 do Hà Ký chủ nhiệm đã nghiên cứu 13 bệnh vi khuẩn trên tôm cá. Lần đầu tiên Việt Nam tập trung nghiên cứu đầy đủ bệnh vi khuẩn với nội dung: phân lập vi khuẩn, tác nhân gây bệnh, dấu hiệu bệnh lý, phân bố và lan truyền bệnh, biện pháp phòng ngừa bệnh. Những bệnh đã nghiên cứu: Bệnh xuất huyết ở cá trắm cỏ nuôi lồng, bệnh xuất huyết ở cá basa nuôi lồng bè, bệnh hoại tử do vi khuẩn ở cá trê, bệnh hoại tử đốm nâu tôm càng xanh, bệnh phát sáng ấu trùng tôm, bệnh đỏ dọc thân ở ấu trùng, bệnh viêm nhiễm sau khi cấy trai ngọc... [21], [13].

Có thể nói rằng với công tác nghiên cứu bệnh ngày càng phát triển, công nghệ được ứng dụng rộng rãi đã mở ra nhiều thành công mới cho ngành thủy sản Việt Nam.

2.3. Giới thiệu vài nét về vi khuẩn Vibrio

2.3.1. Lịch sữ phát hiện bệnh

Vào năm 1883, Canestrini đã phân lập được loài Vibrio anguillarum gây bệnh trên cá chình nuôi ở Địa Trung Hải, đây là loài vi khuẩn đầu tiên thuộc giống Vibrio [29] và những năm tiếp sau đó người ta cho rằng các tác nhân gây bệnh Vibriosis chính loài vi khuẩn này là nguyên nhân.

Tuy nhiên, sự quan tâm ngày càng nhiều đối với nghề nuôi cá trên thế giới đã giúp cho vấn đề dịch bệnh được hiểu một cách rõ ràng hơn đối với mỗi vùng nuôi, từng hệ thống nuôi và vai trò của mỗi loài vi khuẩn trong sự bùng nổ của dịch bệnh. Chẳng hạn, Vibrio alginolyticus là tác nhân thứ cấp tham gia gây bệnh đối với cá tráp nuôi ở Israel khi loài cá này bị thương tổn (Colorni và cộng sự, 1981). Trong khi đó, Vibrio vulnificus được xác định là tác nhân gây bệnh cho cá chình ở Nhật Bản được thông báo bởi Muroga và cộng sự năm 1979 và Bioscas năm 1991. Cùng với Vibrio anguillarum, Vibrio ordalli (Schiewe et al. 1981) và V.salmonicida (Egidius et al. 1986) đã xuất hiện và là những tác nhân gây bệnh rất nguy hiểm cho cá nuôi ở Thái Bình Dương và Đại Tây Dương [24], [30].

Bệnh do vi khuẩn Vibrio đã được phát hiện trên đối tượng nuôi thủy sản là cua xanh (Callinectes sapidus) từ năm 1970 bởi Tukiash khi bệnh xảy ra và gây chết với tỷ lệ > 50%. Đến năm 1977, Fisher đã thông báo các loài tôm hùm châu Mỹ như: Homarus americarus, H. gammarus…hay tôm hùm Châu Á (Panulirus homarus, P. ornatus…) đều có thể bị nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio. Kết quả  này cũng đã được thông báo bởi Roald và Bowser, 1981 [24].

Ngoài ra, Lioo và cộng tác viên của ông đã thông báo hiện tượng tôm sú bị bệnh đỏ thân có liên quan đến thức ăn thối rửa. Nhưng có một số quan điểm khi nghiên cứu và phát hiện bệnh đỏ thân trong các ao nuôi tôm sú ở Philippin với thức ăn tổng  hợp (công nghiệp) cho rằng: bệnh đỏ thân xảy ra có liên quan đến khí độc trong ao nuôi.

Năm 1990, ông Hassawai cho rằng nguyên nhân gây ra bệnh đỏ thân ở Thái Lan là do phẩy khuẩn. Ở Việt Nam, có một số tác giả cho rằng nguyên nhân gây ra bệnh đỏ thân là do tôm ăn Artemia và tảo già. Tuy nhiên theo nghiên cứu của Viện nuôi trồng thủy sản 3 thì bệnh đỏ thân do một giống vi khuẩn Vibrio alginolyticus gây ra trên tôm sú.Cho đến nay bệnh này được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới.

Nghiên cứu của Newman và Feng, 1982 cho biết loài cua đá (Callinectes irroratus) cũng có thể bị chết do cảm nhiễm Vibrio ở 200C sau 24 giờ.

Ở Việt Nam, ngay từ những năm 1989 – 1990 các nhà nghiên cứu đã phát hiện rằng bệnh Vobriosis, đặc biệt là bệnh phát sáng rất phổ biến trong các trại sản xuất tôm sú giống và trong ao nuôi thương phẩm.

Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra xuất hiện quanh năm nhưng thường bùng phát vào mùa có nhiệt độ cao, độ mặn tăng. Hàm lượng Vibrio tăng khi trời đổ giông, bắt gặp vi khuẩn Vibrio ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá (nghiêm trọng nhất ở giai đoạn cá hương và cá giống) [6]. Qua quá trình tồn tại và phát triển, các giống loài Vibrio gây bệnh đã có sự biến đổi cấu trúc gen khác so với ban đầu, việc này dẫn đến hiện tượng kháng thuốc, có tác hại nghiêm trọng đối với sự phát triển của nghề nuôi trồng thủy sản nói chung và nuôi cá biển nói riêng.

2.3.2. Hệ thống phân loại

Vibrio có hệ thống phân loại như sau

Bộ:    Eubactirriles

    Họ:    Vibionaceae

           Giống:    Vibrio

    Giống Vibrio thuộc họ Vibionaceae là những loài vi khuẩn Gram (-), hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0.5 x 1,4 – 2,6 µm. Chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu của vi khuẩn. Tất cả những loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio đều yếm khí tùy tiện. Chúng không phát triển trong môi trường không muối (NaCl), không sinh H2S và không mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129.

Về cơ bản các loài vi khuẩn này đều có mặt trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển và cửa sông, Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả các loài Vibrio và nhiều loài là nhu cầu tuyệt đối.

TCBS là môi trường chọn lọc của Vibrio. Hầu hết các loài đều phát triển trong môi trường nước biển cơ bản, ion Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả các loài Vibrio và đối với nhiều loài là nhu cầu tuyệt đối, chúng sẽ không phát triển nếu như trong môi trường không có muối (NaCl), không sinh H2S, mẫn cảm với Vibriostat 2,4 diamino - 6,7, diisopropyl pteridine phosphate.[20], [31], [32], [33].

Vi khuẩn Vibrio có thể gây bệnh trên tất cả các giai đoạn phát triển của cá bệnh nên  thường gây tác hại lớn, chúng tấn công vào tim và hệ cơ của cá. Đối với ấu trùng cá hay giai đoạn cá hương, cá giống khi nhiễm nặng tỷ lệ chết có thể lên đến 50%. Việc điều trị bệnh gắp rất nhiều khó khăn do hiện tượng kháng thuốc và hiện nay con đường sử dụng thảo dược để phòng trị bệnh đang là một giải pháp tốt nhằm ngăn chặn những thiệt hại do dịch bệnh mang lại.

2.4. Tình hình dịch bệnh gây ra trên cá chẽm

2.4.1. Trên thế giới

Cá chẽm là đối tượng đã được sinh sản nhân tạo, vì thế có được nguồn giống cung cấp chủ động cho người nuôi và cũng từ đây nghề nuôi cá chẽm phát triển mang lại nhiều thành công. Sản lượng cá chẽm trên thế giới được biểu thị bởi biểu đồ hình 2.1

Tuy nhiên, bên cạnh lợi thếđó nghề  nuôi cá chẽm thường xuyên gặp phải những tác hại do dịch bệnh gây ra và gây thiệt hại lớn cho các quốc gia. Nhiều bệnh đã được thông báo ở Australia, Hồng Kông, Úc, các nước Đông Nam Á và Nhật Bản.

 Ở Thái Lan năm 1989 dịch bệnh trên cá chẽm, cá mú gây thiệt hại 1,9 triệu USD, hằng năm có 80% người nuôi báo cáo là dịch bệnh gây chết 30 – 50% tổng sản lượng. Nhật Bản năm 1992 thiệt hại 114,4 triệu USD. Malaysia dịch bệnh do Vibrio làm thiệt hại 20 triệu Ringit năm 1992. Năm 1993 ở Singapore chỉ riêng hai trại nuôi cá biển bị bệnh đã thiệt hại 360 000 USD. Phillipines thông thường khoảng 75% trại nuôi cá biển bị bệnh hằng năm [28], [30].

Theo Lilley & ctv (1999), bệnh xuất huyết ở cá tại một số nước châu Á trước năm 1990 đã gây tổn thất hơn 10 triệu USD. Trong khoảng 10 năm từ năm 1983 đến 1993, riêng bệnh xuất huyết lở loét đã gây  thiệt  hại khoảng 100 triệu  USD (Chinabut, 1994) [3].

Theo Schipt (1996) thì những con đường chính làm nhiễm bệnh ở cá chẽm là lây nhiễm qua nguồn nước, thức ăn hay cá khác. Ruangpanit (1981, 1984) cho rằng tác nhân gây bệnh ở cá chẽm là ký sinh trùng, vi khuẩn, virus, bệnh do suy dinh dưỡng và bệnh do sốc môi trường, trong đó bệnh do ký sinh trùng khá phổ biến.

Theo Juario (1987) thì bệnh do vi khuẩn Vibrio sp gây chết toàn bộ ở ngày thứ 22 – 25 khi ương cá chẽm ở bể chứa ngoài trời với nhiệt độ 26 – 320C, độ mặn 35 – 37‰, sự chiếu sáng và tảo khuê nở hoa đầy đặc (Bagarinao & Kungvankij, 1986). Theo Kungvankij & Cộng tác viên (1986) dấu hiệu bệnh lý thường thấy ở cá chẽm giai đoạn cá hương là: kém ăn, tróc vẩy, màu sắc cơ thể thay đổi từ màu xám sang màu đen, trên cơ thể có đốm trắng xuất hiện. Việc chữa trị được tiến hành ngay khi thấy bất kỳ dấu hiệu bệnh lý nào xuất hiện. Theo Awang trong quá trình ương giống cá chẽm, hiện tượng chết hàng loạt thường xảy ra vào ngày thứ 14 – 18 có liên quan đến vấn đề dinh dưỡng. Do thành phần thức ăn sống (Roti – fer) cung cấp cho cá bột thiếu axít béo chưa bảo hòa (PUFA) [24].

Một số tác giả khác lại cho rằng hiện tượng chết hàng loạt của cá bột xảy ra vào ngày thứ 12 – 14 là do có liên quan đến các tác nhân gây độc, đặc biệt là Amonia (Hamhrey & Langdon, 1986). Sự kết hợp các dấu hiệu khác nhau có thể nhìn thấy rõ ràng dưới kính hiển vi có độ phóng đại thấp, trong nhiều trường hợp cá bột nổi lên mặt nước và có thể nhìn thấy rõ trong bóng hơi sưng phồng có màu sáng.

Một số bệnh bùng nổ trong lồng nuôi cá chẽm thì vi khuẩn được thông  báo là tác nhân gây bệnh quan trọng nhất, các vi khuẩn liên quan đến gây bệnh cho cá chẽm là: Aeromonas hydrophyla, Flexibacter columnaris, Vibrio sp và Pseudomonas sp (Burapanigiger & Donayadol, 1984) và một số tác giả nghiên cứu và tổng kết trong nhiều tài liệu khác [23],  [25].

Gần đây, một hướng đi mới đã và đang được mở ra trong việc quản lý tốt sức khỏe cá nuôi là dùng vacxin để  phòng bệnh. Vacxin đã được dùng thành công ở châu Âu trong nghề nuôi cá hồi đối với các bệnh nhiễm khuẩn nguy hiểm: bệnh do Vibrio, bệnh lở loét, bệnh đường ruột (Ellis, 1997; Gudding & ctv (1997) [6]. Ở  châu Á, việc nghiên cứu và  ứng dụng vacxin trong việc phòng bệnh nguy hiểm ở cá chẽm đã đạt được những thành công nhất định. Tuy vậy ở thời điểm hiện tại, vấn đề bệnh và dịch bệnh vẫn là nỗi lo lắng thường trực và mối quan tâm hàng đầu của người nuôi cá chẽm tại các quốc gia Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam.

2.4.2. Ở Việt Nam

 Nghề nuôi cá chẽm đã được nuôi trong khoảng 10 năm trở lại đây, chủ yếu ở các tỉnh miền Trung như: Khánh Hòa, Thừa Thiên Huế và hiện nay một số tỉnh khác đang nuôi thử nghiệm cá chẽm như : Thanh Hoá, Thái Nguyên, Thái Bình, Hà Giang, Hà Tĩnh... nhưng những năm gần đây dịch bệnh đã làm điêu đứng cho người nuôi, ảnh hưởng lớn đến kinh tế của từng hộ gia đình.

Tại  Khánh Hòa, có khoảng 30% hộ nuôi xảy ra dịch bệnh ở giai đoạn cá nhỏ từ 5 – 20 cm, nuôi lồng thường chịu tác hại nặng hơn giai đoạn cá lớn. Tỷ lệ chết có thể đạt 50 – 100%, đây là bệnh không có mùa vụ rõ ràng (Đỗ Thị Hòa, 2008). Nha Trang – Vũng Ngán, dịch bệnh lây lan rất nhanh và gây chết 100% cá trong vòng 1 tuần. Khi cá trong lồng bị bệnh còn quan sát được một số loài cá khác sống xung quanh lồng cũng có dấu hiệu cụt đuôi tương tự [28], [30].

Ở Hải Dương huyện Hương Trà tỉnh Thừa Thiên đã xảy hiện tượng cá Chẽm đang ương, nuôi từ 1 đến 2 tháng tuổi chết từ rải rác đến hàng loạt, số lượng thiệt hại ước 15 vạn trên 25 vạn thả ương, nuôi. Với tổng giá trị thiệt hại khoảng 450 triệu đồng [30].

Theo PGS.TS Đỗ Thị Hòa, trường Đại học Thủy sản Nha Trang đã nghiên cứu Vibrio là tác nhân chính gây chết trên cá chẽm, tỷ lệ cao ở cá nuôi lồng (100%), cá nuôi ao gặp thấp hơn (58,2%). Một số loài vi khuẩn Vibrio spp đã phân lập được từ nội tạng cá bệnh, trong đó Vibrio anguillarum đã gây bệnh trong điều kiện cảm nhiễm nhân tạo (60 – 80%) [21].

Theo Nguyễn Thanh Chương và Đồng Thanh Hà, vi khuẩn phân lập được trên mẫu bệnh cá chẽm tại xã Hải Dương, huyện Hương Trà, Tỉnh Thừa Thiên Huế bao gồm: Vibrio cholera, Flexibacter – like, Aeromonas allosacharophila [5]

2.5. Chế phẩm Bokashi trầu

Là chế phẩm sinh học chưa được sử dụng phổ biến do ít được biết đến. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy Bokashi trầu sản sinh ra nhiều chất có khả năng ngăn chặn bệnh và tăng sức đề kháng cho đối tượng nuôi. Bokashi trầu, sản phẩm kết hợp từ chế phẩm EM và lá trầu, một nguyên liệu rẻ tiền và dể kiếm ở địa phương để phòng và trị bệnh cho động vật thủy sản. Qúa trình sản xuất Bokashi trầu dựa trên quá trình lên men giữa lá trầu và dung dịch EM thứ cấp trong điều kiện yếm khí. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Phước và cộng tác viên (2007) cho thấy Bokashi có khả năng diệt khuẩn tốt, độ an toàn cao đối với vật nuôi và thân thiện với môi trường. Nghiên cứu này cho thấy chế phẩm EM khi kết hợp với lá trầu có thể ức chế và tiêu diệt hai loài vi khuẩn Vibrio parahemolyticus và Aeromonas hydrophyla, đây là hai loài vi khuẩn gây bệnh phổ biến trên động vật thủy sản nước ngọt và nước mặn, nên việc sử dụng chế phẩm này sẽ góp phần hạn chế việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản.

2.5.1. Cây trầu không

Trầu không là loại cây mọc leo, thân nhẵn. Lá mọc so le, cuống có bẹ, dài 1.5 – 3,5 cm, phiến lá hình trái xoan, dài 10 – 13 cm, phía cuống hình tim, đầu lá nhọn, ki soi lên có chứa tinh dầu rất nhỏ [19], [9]. Cây trầu không được trồng ở khắp nơi trên đất nước ta để lấy lá ăn trầu. Nó cũng được trồng ở các nước Châu Á khác, vùng nhiệt đới như Malaysia, Indonexia, Trung Quốc, Thái Lan, Ấn độ [9].

Lá trầu chứa từ 0,8 – 1,8% tinh dầu thơm, có vị nồng trong lá Trầu có chứa Chavicol, chavibetle và một số hợp chất khác của phenonic, Chúng có tác dụng kháng sinh rất mạnh đối với các loại vi trùng, tụ cầu khuẩn, liên cầu khuẩn, song cầu khuẩn, vi khuẩn Bacillus subtilis và trực trùng E. coli, trầu thường đựơc người dân dùng để chữa trị các bệnh vi khuẩn trên người [9], [ 18].

Tại Malaysia, trầu được sử dụng để điều trị chứng đau đầu, viêm khớp và các thương tổn khớp. Tại Thái Lan và Trung Quốc, người ta dùng trầu để làm dịu bệnh đau răng. Tại Indonesia, trầu được uống như một loại trà và sử dụng như là thuốc kháng sinh. Trầu còn được sử dụng trong trà để điều trị chứng khó tiêu, chứng táo bón cũng như trong thuốc mỡ hay thuốc hít để điều trị đau đầu, giúp thông mũi. Ngoài ra, tinh dầu trầu có tác dụng hạ huyết áp, duỗi bắp cơ, trị giun sán, chữa dị ứng [30].

Ở Việt Nam từ xưa đã có tục ăn trầu. Ăn trầu có tác dụng bảo vệ răng miệng, làm cho cơ thể ấm lên. Lá trầu có chứa một số hợp chất của phenol sát khuẩn mạnh thường được dùng ngoài để chữa các bệnh nhiễm khuẩn . Ngoài ra, nước lá trầu còn dùng để rửa các vết loét, mẫn ngứa, viêm mạch bạch huyết, trị chốc lở. Dịch chiết lá trầu dùng để chữa viêm kết mạc, chữa bệnh chàm mặt ở trẻ em, bã lá trầu đắp lên ngực để chữa ho.

Năm 1956, bộ môn ký sinh trường Đại học Y Dược Hà Nội đã nghiên cứu và cho biết lá trầu có tác dụng diệt khuẩn mạnh. Tại Việt Nam, lá trầu được dùng để điều trị bệnh vi khuẩn trên người. Năm 2006, Nguyễn Ngọc Phước và cộng sự đã nghiên cứu và kết luận khả năng kháng nấm của dịch chiết lá trầu, các hợp chất chủ yếu trong lá trầu như là betel – phenol, chavicol và cadien có khả năng tiêu diệt nấm cũng như các loài vi khuẩn gây bệnh.

2.5.2. Chế phẩm EM

Vi sinh vật hữu hiệu EM là tập hợp các loài vi sinh vật có ích (vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn lactic, nấm men, xạ khuẩn, nấm mốc), sống cộng sinh trong cùng một môi trường. Có thể áp dụng chúng như một chất cấy nhằm tăng cường tính đa dạng của vi sinh vật đất, bổ sung các vi sinh vật có ích vào môi trường tự nhiên do các vi sinh vật có hại gây ra. Kết quả là có thể cải thiện chất lượng và làm tốt môi trường đất, chống bệnh do vi sinh vật gây ra và tăng cường hiệu quả của việc sử dụng chất hữu cơ của cây trồng.

Công nghệ EM do Giáo sư – tiến sĩ Teruo Higa, trường Đại học Tổng hợp Ruykyus – Okinawa – Nhật Bản sáng tạo ra và được áp dụng vào thực tiễn năm 1980. Ông đã kiên trì đấu tranh cho quan điểm mở rộng các chế phẩm sinh học, tiến tới giảm thiểu và đẩy lùi việc sử dụng phân bón hóa học, thuốc trừ sâu, trừ bệnh bằng hóa học.

2.6. Tình hình sử dụng hợp chất chiết xuất từ thảo dược phòng trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản

2.6.1. Trên thế giới

Song song với việc tăng năng suất và sản lượng nuôi một cách ồ ạt đã khiến cho dịch bệnh ngày càng lan tràn, đây là một vấn đề gây nhức nhối cho ngành thủy sản nói chung và người nuôi nói riêng. Mặc dù trong công tác phòng trừ dịch bệnh con người đã sử dụng các loại hóa chất, thuốc kháng sinh, nhưng thành quả của nó mang lại không cao và  chính sự tồn dư của các loại hóa chất độc hại, kháng sinh đã gây ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người. Mặt khác việc sử dụng các loại hóa chất và kháng sinh không đúng quy cách và liều lượng đã gây ảnh hưởng lớn đến môi trường và sinh thái nghề nuôi. Trong những năm gần đây, xu hướng sử dụng thảo dược có biên độ an toàn lớn, ít ảnh hưởng đến môi trường sinh thái cũng như môi trường nuôi và không ảnh hưởng tới sức khỏe con người [15]

Năm 1880, Davaine đã bắt đầu nghiên cứu tính kháng khuẩn của lá Hồ Đào đối với vi khuẩn Bacillus anthracis. R.Koch (1887) cũng đã nghiên cứu chứng minh tính kháng khuẩn của nhiều loại tinh dầu. Năm 1959, Horak và Santavi chiết xuất từ cannabit sativa – Cannabinnacea, được chất Cannabiriolic, dung dịch 10 – 15 µg/ml có tác dụng diệt khuẩn với vi khuẩn gây bệnh lao ở người, vi khuẩn Gram (+), đặc biệt đối với vi khuẩn kháng lại Penicillin.

Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được công dụng diệt vi khuẩn của tỏi. Năm 1944, nhà bác học Chester J. Cavallito đã phân tích được hợp chất allicin trong tỏi có công dụng như thuốc kháng sinh. Allicin chỉ có trong tỏi chưa nấu hay chế hóa. Năm 1948, Marchado cùng cộng sự đã chiết xuất từ tỏi được garcilin, chất này không có mùi lưu huỳnh, không độc, ứng dụng tốt trong bệnh nhiễm trùng Shigella, Salmonella hoặc các bệnh ký sinh trùng như giun kim, giun đũa, giun tóc. Một ngiên cứu khác tại Brazil năm 1982 đã chứng minh nước tinh chất của tỏi có thể chữa được nhiều bệnh nhiễm độc bao tử, do thức ăn có lẫn vi khuẩn.

Một nghiên cứu khác của Tokin (1928) đã chứng minh nhiều chất bay hơi từ cây xanh có tác dụng với vi khuẩn được gọi là Phytocid, nhiều công trình nghiên cứu đã xác nhận rằng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật rất phong phú và có phạm vi ứng dụng rộng rãi [13], [18].

Ở Trung Quốc, Khuê Lập Trung (1985) đã đưa ra 22 loài thảo dược, chủ yếu phòng trị bệnh nhiễm khuẩn, ngoại ký sinh trùng và bệnh đường ruột cho tôm, cá, nhuyễn thể. Các loại thảo dược đó là: Xuyên Tâm liên, Địa Niên thảo, Lưu Xổ tử, Quản trọng, Ngũ Bội tử, Tiền thảo,… [19]

Tại Thái Lan, Sataporn Direkbusara Kom và cộng sự (1997 đã tiến hành thử  nghiệm tác dụng của các loại Ocinum sanctum, Eclipta alba, Cassia alata, Tinospora cordifolia, T.crispa, P.acidus và C.inphyllum có tác dụng diệt khuẩn đối với vi khuẩn Vibrio spp và nồng độ ức chế tối thiểu là 1mg/ml, liều gây chất 50% đối với postlarva 15 sau 24 giờ là 1,987 – 3,548 ppm. Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loài thảo dược như: Ocinum sanctum, Eclipta alba, Cassia alata, Tinospora cordifolia, T.crispa, Psidium guajava, Clinacanthus, Andorgaphic panniculata, Momordica charatina, Phyllanthus reticulates, P.pulcher,  P.acidus, P.debelis, P.amarus, P.debelzs, P.urinaria đối với vi khuẩn Vibrio spp. Tuy nhiên, chỉ có hai cây Psidium guajava, Momordica charatina có hiệu quả ức chế đối với vi khuẩn Vibrio spp. Nồng độ ức chế tối thiểu của Psidium guajava là 0,625 mg/ml và Momordica charatina là 1,25 mg/ml [19].

Các kết quả chỉ mới bước đầu thử nghiệm sàng lọc các loại thảo dược chưa xác định được thành phần nào trên thực vật có tác dụng đối với vi khuẩn và virus [19].

2.6.2. Ở Việt Nam

Từ giữa thế kỷ XX trở lại đây, nghiên cứu thực nghiệm đã xác định tính kháng khuẩn thực vật mới bắt đầu được chú ý. Năm 1956, Phạm Văn Ngữ đã nghiên cứu trên 500 cây thuốc và khẳng định nhiều cây có tính kháng khuẩn mạnh. Công trình nghiên cứu về các loài thảo dược của Nguyễn Văn Hưởng và cộng sự (1959) đã đưa ra chế phẩm Tô mộc trị kiết lỵ sau khi nghiên cứu trên 1000 cây thuốc về tính kháng khuẩn. Việc ngiên cứu tính kháng khuẩn của cây Tô mộc cho thấy, các loài thảo dược này có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn cả Gram (+), Gram (-). Tác dụng kháng khuẩn của cây Tô mộc rất bền, giữ được hoạt tính trên in – vitro, liều điều trị và liều độc có khoảng cách an toàn rộng. Trường Đại hoc Quân y đã nghiên cứu tính kháng khuẩn của cây Loong – tơ – uyn và nhiều cây thuộc họ ráy, đua ra chế phẩm Loong – tơ – uyn được ứng dụng trong điều trị các vết thương nhiễm trùng, đặc biệt là trực khuẩn gây bệnh mủ xanh (Bacterium pyocyaneum). Mặc dù quá trình ngiên cứu các loại thảo dược trong phòng trị bệnh ở người đã được tiến hành từ lâu nghiên cứu thảo dược mới bắt đầu ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản [18].

Ở miền Bắc, Hà Ký (1995) và cộng sự trong chương trình KN 04 – 12 đã nghiên cứu một số loài thảo dược dùng để phòng trị bệnh trên cá trắm. Bước đầu đã chon được 9 loài cây thuốc sau: Rau nghể (polygonum hydropiper), rau sam (Portulaca cleracea), cây cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta), cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolis), sài đất (Wedelia calendu lacae), nhọ nồi (Eclipta alba), bồ công anh (Lactuca indica), cây vòi voi (Heliotropium indicum) và cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria) là những loài thảo dược có thể sử dụng trong phòng và trị bệnh đốm đỏ cho cá trắm cỏ.

Ở miền Nam, người dân khu vực nuôi bè ở Tân Châu – Châu Đốc (An Giang), Hồng Ngự (Đồng Tháp),…đã dùng cây cỏ mực (Eclipta alba), cây trầu không (Piper betle) để trị bệnh ký sinh trùng cho cá, lá ổi (Psidium guajava) để chữa bệnh đường ruột do vi khuẩn gây ra cho cá tra, basa.

PHẦN 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Đối tượng nghiên cứu

- Cá chẽm(Lates calcarifer)

- Vi khuẩn phân lập được từ mẫu cá chẽm giống bị bệnh

- Chế phẩm Bokashi trầu

3.2. Địa điểm nghiên cứu

3.2.1. Địa điểm thu mẫu

Mẫu cá được thu tại các lồng nuôi ở xã Hải Dương, huyện Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế

3.2.2. Địa điểm phân tích mẫu

- Phòng thí nghiệm khoa Thủy sản, Trường Đại học Nông Lâm Huế

- Khoa vi sinh, Bệnh viện Trung Ương Huế

3.3. Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 01/2011 đến tháng 05/2011

3.4. Vật liệu nghiên cứu

3.4.1. Dụng cụ thí nghiệm

- Dụng cụ bố trí thí nghiệm: các đĩa peptri thạch

- Dụng cụ thí nghiệm: cân điện tử, thước đo, kim tiêm, đèn cồn, que cấy, bông tẩm cồn, gang tay, bộ giải phẩu.

- Dụng cụ phân tích mẫu bệnh: ống nghiệm vô trùng các loại, đĩa peptri, que cấy vô trùng, que gạt thủy tinh vô trùng, đĩa thủy tinh, đèn cồn, lamen, lam, pipet, tủ lạnh, kính hiển vi, nước muối sinh lý, nước cất, khay sạch...

3.4.2. Môi trường và hóa chất

            - Môi trường nuôi cấy tổng hợp: NA + 2% NaCl

- Môi trường đặc trưng: TCBS

- Môi trường tăng sinh: pepton

- Môi trường dùng cho phản ứng sinh hóa: Saccharose, Glucose, Lactose, Mannitol, Maltose, Simons Citrat Agar, KIA, MR, VP, O/F

- Các hóa chất sử dụng cho test sinh hóa và nhuộm Gram: Thuốc thử Methyl Red, α – Naphthol và KOH, kovacs, dùng cho các phản ứng MR, VP và phản ứng sinh Indol. Dung dịch Crystal violet, dung dịch Fushine, dung dịch Lugol, dung dịch cồn 960.

3.5. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu, phân lập vi khuẩn gây bệnh trên cá chẽm(Lates calcarifer)

- Thử nghiệm nồng độ ức chế, nồng độ tiêu diệt vi khuẩn của Bokashi trầu đối với vi khuẩn phân lập được trên cá chẽm giống bệnh.

3.6. Phương pháp nghiên cứu

3.6.1. Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn

3.6.1.1. Phương pháp thu mẫu

Thu mẫu chọn lọc: chọn những con có dấu hiệu đặc trưng như bỏ ăn, bơi lờ đờ, trên thân có các vết loét, mòn cụt các vây, ...cá được thu nguyên con, còn sống hoặc vừa mới chết. Có thể sử dụng sục khí để vận chuyển mẫu.

3.6.1.2. Phương pháp nuôi cấy, phân lập

Phương pháp phân lập xác định vi khuẩn gây bệnh dựa trên phương pháp nghiên cứu của Bergey (1957) và Nguyễn Lân Dũng (2006). Các thao tác trong điều kiện vô trùng bằng đèn cồn.

     Nuôi cấy trên môi trường tổng hợp

- Mẫu sau khi đo chiều dài, cân trọng lượng tiến hành:

- Lấy máu nuôi cấy trên môi trường NA + 2% NaCl

- Lấy gan, thận nghiền nát với nước muối sinh lý thành dung dịch huyền phù. Dùng xilanh lấy 0,1 ml dung dich huyền phù nhỏ lên môi trường NA + 2% NaCl, dùng que cấy tam giác dàn đều trên bề mặt thạch. Giữ các đĩa cấy ở nhiệt độ phòng, sau 24 – 48 giờ quan sát khuẩn lạc.

Sau 24 giờ, chọn những khuẩn lạc có màu sắc đặc trưng, chiếm ưu thế đem nuôi cấy chuyền lần 1 trên môi trường NA + 2% NaCl và tiếp tục quan sát màu sắc, hình dạng khuẩn lạc sau 24 – 48 giờ. Qúa trình cấy chuyền cho đến lần thứ 3.

     Nuôi cấy trên môi trường đặc trưng

Trên các đĩa khuẩn lạc được cấy chuyền trên môi trường NA+2%NaCl. Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc đã chọn cấy lên môi trường TCBS theo đường dích dắc. Giữ các đĩa cấy ở nhiệt độ phòng, sau 24 – 48 giờ quan sát khuẩn lạc thuần chủng mọc trên môi trường thạch.

     Thử các phản ứng sinh hóa và nhuộm Gram

Lấy vi khuẩn dòng thuần từ môi trường TCBS để thực hiện các phản ứng test sinh hóa. Sau 24 – 48 giờ ghi lại kết quả trên các ống nghiệm.

Các bước nhuộm Gram thực hiện theo phương pháp của Chritian Gram (1884) để xác định loại vi khuẩn.

            Dùng que đã diệt khuẩn để lấy mẫu (khuẩn lạc) đặt lên lam kính, dàn mỏng, nhỏ dung dịch Violet (màu tím) lên mẫu để 30 – 60 giây.

            Rửa nhanh bằng nước, rảy khô

            Nhỏ dung dịch Lugol lên mẫu để 1 phút

            Rửa nhanh rảy khô

            Nghiêng lam kính, nhỏ cồn 96% lên để tẩy màu

            Rửa nhanh bằng nước, rảy khô

            Nhỏ dung dịch Fushin lên mẫu, để 1 – 2 phút

            Rửa nước, rảy khô dùng khăn giấy thấm làm khô tiêu bản

Nhỏ dầu lên tiêu bản, đem soi dưới kính hiển vi (vật kính dầu) nếu mẫu giữ nguyên màu xanh tím là vi khuẩn Gram (+), nếu mẫu chuyển sang màu hồng là vi khuẩn Gram (-).

     Định danh vi khuẩn

Dựa trên kết quả từ phản ứng nhuộm Gram và thử test sinh hóa, định danh vi khuẩn theo khóa phân lập của Bergey (1957) và Nguyễn Lân Dũng (2006).

     Nuôi cấy tăng sinh

Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn trên môi trường pepton lỏng ở nhiệt độ 300C để đạt mật độ cần thiết 106 giúp cho quá trình giữ giống và bố trí thí nghiệm.

     Xác định mật độ tế bào vi khuẩn

Chuẩn bị một số ống nghiệm vô trùng, mỗi ống chứa 9 ml nước muối sinh lý. Lấy 1 ml mẫu dung dịch pepton chứa vi khuẩn cần nghiên cứu, đưa sang ống nghiêm thứ nhất làm đồng đều ta được độ pha loãng 10 (10-1).Lấy 1 ml nước ở ống nghiệm 10-1 cho vào ống nghiệm thứ 2được độ pha loãng 100 lần (10-2), cứ làm như thế đến khi đạt được độ pha loãng tiếp theo: 10-3, 10-4, 10-5,10-6­.

Lấy 0,1 ml nước nghiên cứu ở 2 – 3 độ pha loãng khác nhau, nuôi cấy trên đĩa thạch chứa môi trường cần thiết bằng que gạt. Mỗi nồng độ pha loãng nuôi cấy từ 2 – 3 đĩa lồng. Nuôi cấy ở nhiệt độ 30 – 370C, sau 24 giờ, đem ra đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, lấy giá trị trung bình của các đĩa lồng có cùng nồng độ pha loãng. Mật độ vi khuẩn tính theo công thức:

X = A.K/V

Trong đó:       X: Mật độ vi khuẩn.

                        A: Số lượng khuẩn lạc trung bình trong 1 độ pha loãng.

                        V: Thể tích nước đưa vào nuôi cấy.

                        K: Hệ số pha loãng.

Dùng máy đo độđục của Macfaland để so màu nhằm xác định nồng độ vi khuẩn.

3.6.2. Phương pháp nghiên cứu tác dụng của Bokashi trầu lên sự phát triển của vi khuẩn phân lập được

3.6.2.1. Phương pháp sàng lọc nồng độ

Thí  nghiệm được bố trí trên 24 giếng nhựa chứa 2 ml pepton với các nồng độ Bokashi trầu pha loãng 10 lần và được lặp lại 3 lần. Khối thạch có vi khuẩn phát triển trên đó được cắt bằng dụng cụ chuyên dụng với đường kính 5,5 mm, sau đó được cho vào trong các giếng, ngâm trong 24 giờ. Các khối thạch sau khi ngâm trong các giếng ở các khoảng thời gian được đưa vào nuôi cấy ở các đĩa thạch TCBS. Xem xét khả năng phát triển của khuẩn lạc sau 1 ngày, 2 ngày và 7 ngày.

3.6.2.2. Phương pháp xác định nồng độ ức chế

            Từ kết quả thí nghiệm thứ nhất, nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu sẽ được thử nghiệm ở thí nghiệm thứ 2, tiến hành pha loãng thành các nồng độ cần thử để bố trí thí nghiệm sàng lọc nồng độ ức chế Chế phẩm Bokashi trầu với các nồng độ giảm dần 2 lần sẽ được đưa vào các giếng nhựa với thể tích 2 ml chứa pepton.

Các khối thạch có vi khuẩn phát triển trên đó được ngâm trong giếng 24 giờ. Sau đó nuôi cấy trong môt trường thạch TCBS. Sau 1 ngày, 2 ngày và 7 ngày kiểm tra sự phát triển của khuẩn lạc nuôi cấy trong môi trường TCBS ở nhiệt độ 300C.

3.6.2.3. Phương pháp xác định nồng độ tiêu diệt

            Từ kết quả của thí nghiệm thứ hai, nồng độ Bokashi trầu có khả năng kháng khuẩn tốt nhất sẽ được sử dụng cho thí nghiệm này. Các khối thạch có vi khuẩn phát triển trên đó được ngâm trong các môi trường có chứa các nồng độ Bokashi trầu khác nhau trong 15 phút, 30 phút, 1 giờ và 24 giờ. Sau đó được rửa sạch 3 lần với nước cất và nuôi cấy trong môt trường thạch TCBS.

Xác định khả năng tiêu diệt vi khuẩn của Bokashi trầu bằng cách so sánh sự phát triển của khuẩn lạc trong môi trường TCBS ở các nghiệm thức có bổ sung Bokashi trầu với các nghiệm thức đối chứng là khối thạch được ngâm trong nước cất. Nếu khuẩn lạc không phát triển thì tiếp tục theo dõi đến ngày thứ 3.

Giải phẩu mẫu bệnh       

Thu mẫu bệnh            

Sơ đồ 3.2. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

sự phát triển trở lại của vi khuẩn

3.7. Phương pháp xử lí số liệu

            Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Exel 2003.

3.7.1. Giá trị trung bình

                                     = 

            Trong đó:       : Giá trị trung bình

                                     Xi :    Giá trị của mỗi lần đo

                                     n :      Số lần đo

3.7.2. Độ lệch chuẩn

            Trong đó:       : Giá trị trung bình                 

                        Xi:     Giá trị trung bình                    

 n :      Số lần đếm

 :    Độ lệch chuẩn

PHẦN 4

 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1. Trọng lượng, chiều dài cá chẽm bị bệnh

Kiểm tra trọng lượng, chiều dài mẫu bệnh phẩm đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh trên động vật thuỷ sản do mỗi loại tác nhân thường cảm nhiễm ở một giai đoạn nhất định của đối tượng nuôi. Việc ghi chép tỷ lệ chiều dài/trọng lượng là rất cần thiết cho việc phát hiện bệnh sớm, nhờ đó con người có thể sử dụng các biện pháp kỹ thuật can thiệp nhằm làm giảm bớt nguy cơ dịch bệnh cho đối tượng nuôi.

Cá chẽm rất dễ mẫn cảm với nhiều loại tác nhân gây bệnh nên việc xác định giai đoạn phát triển của cá sẽ giúp khoanh vùng được tác nhân gây bệnh, để đưa ra kết quả chính xác hơn trong quá trình phân lập.

Qua 3 lần thu mẫu, kết quả kiểm tra trọng lượng và chiều dài của đối tượng nghiên cứu được thể hiện ở bảng 4.1

Trọng lượng (g/con)

MD ± SD

Chiều dài (cm/con)

MD ± SD

5.35 ± 0.25

7.2 ± 0.2

Qua bảng 4.1 ta thấy, cá chẽm bị bệnh có trọng lượng trung bình 5 g/con, chiều dài trung bình 7 cm/con. Điều này cho thấy cá chẽm giai đoạn này còn nhỏ, sức đề kháng còn yếu nên rất dễ mắc bệnh khi môi trường thay đổi và có tác nhân xâm nhập đặc biệt là đối với tác nhân cơ hội luôn tồn tại trong môi trường nước như Vibrio.

4.2. Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn

4.2.1. Kết quả quan sát dấu hiệu bệnh lý

§        Dấu hiệu bên ngoài

Màu sắc cơ thể nhợt nhạt, trên thân có các vết loét rất nhỏ và vảy bị tróc đặc biệt ở vùng lưng. Vây bụng và vây đuôi bị xơ rách, mòn cụt nhưng xảy ra nhiều hơn ở vây đuôi. Mang tái nhợt, có nhiều nhớt hơn bình thường.

§        Giải phẩu bên trong

Xoang bụng không có hiện tượng tích dịch. Gan, thận, lá lách không có dấu hiệu bị phù, ruột chứa ít thức ăn.

§        Trạng thái hoạt động: cá lờ đờ, bơi chậm.

4.2.2.  Kết quả quan sát khuẩn lạc

            Sau 3 đợt thu mẫu, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên hai loại môi trường khác nhau và kết quả đạt được như sau:

- Trên môi trường NA + 2% NaCl: Xuất hiện một loại khuẩn lạc màu trắng, tròn, đường kính 2 – 3 mm. Sau đó tiến hành chọn những khuẩn lạc tròn, rời, chiếm ưu thế cấy chuyền trên môi trường NA + 2% NaCl 3 lần và kết quả cũng cho duy nhất một loại khuẩn lạc màu trắng (hình 4.5)

- Trên môi trường TCBS: Sau khi cấy chuyền nhiều lần trên môi trường NA + 2% NaCl đã cho khuẩn lạc thuần, chúng tôi lấy khuẩn lạc cấy lên môi trường TCBS, kết quả quan sát khuẩn lạc sau 24 giờđược thể hiện ở bảng 4.2  và hình 4.6A, 4.6B.

Bảng 4.2. Kết quả quan sát khuẩn lạc trên môi trường TCBS

Loại khuẩn lạc

Loại 1

Loại 2

Hình dạng

Tròn, to, không đều

Tròn, nhỏ, đều

Màu sắc

Xanh

Vàng

Đường kính khuẩn lạc (mm)

3,2 – 3,9

1,4 – 1,8

Đặc điểm khuyếch tán

Không làm biến đổi màu môi trường nuôi cấy

Làm biến đổi màu môi

trường nuôi cấy

4.2.3. Kết quả nhuộm Gram

Từ hai loại khuẩn lạc màu vàng và xanh thu được, chúng tôi tiến hành nhuộm Gram để kiểm tra. Kết quả quan sát trên kính hiển vi soi dầu ở vật kính 100x cho thấy cả hai chủng vi khuẩn trên đều có tế bào dạng hình que ngắn, bắt màu hồng thuốc nhuộm Fushine (hình 4.3 và 4.4). Từ kết quả này chúng ta kết luận, hai chủng vi khuẩn này là vi khuẩn Gram (-)

Theo Đỗ Thị Hòa và Bùi Quang Tề (2004), sở dĩ vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng của thuốc nhuộm Fushin là do vi khuẩn Gram (-) chỉ có vách peptidoglucan ở một phía của tế bào, nên trong quá trình nhuộm Gram dưới tác dụng của cồn 950, thuốc nhuộm Crystal violet đã bị tẩy sạch, tạo điều kiện cho tế bào vi khuẩn bắt màu hồng của thuốc nhuộm thứ 2 là Fushine.

4.2.4.  Kết quả thử phản ứng sinh hóa

Chúng tôi tiến hành thử phản ứng sinh hóa trên cả hai chủng vi khuẩn phân lập được từ mẫu cá nghiên cứu, kết quả thử phản ứng sinh hóa được thể hiện  ở bảng 4.3

Bảng 4.3.Kết quả thử phản ứng sinh hóa

Đặc điểm sinh hoá

Kết quả

Chủng 1

Chủng 2

Màu sắc khuẩn lạc

Xanh

Vàng

Acid hoá Glucose

+

+

Acid hoá Lactose

+

+

Acid hoá Sacarose

-

+

Phản ứng Methyl red

+

-

Phản ứng KIA

+/+

+/+

Phản ứng Citrat

-

-

Sinh hơi từ Glucose

+

-

Indol

+

+

Phản ứng MR – VP

-

-

Khả năng di động

Không di động

Không di động

Khả năng sinh H2S

-

-

Kết luận

V. harveyi

V. alginolyticus

Sau khi phân lập để phát hiện ra các chủng vi khuẩn gây bệnh, để xác định được tên loài, chúng tôi đã tiến hành quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc trên môi trường TCBS. Đồng thời quan sát hình dạng, kích thước tế bào trên kính hiển vi quang học và thử phản ứng sinh hóa.

Từ các kết quả trên, dựa vào một số tài liệu định danh vi khuẩn “Hệ thống phân loại vi khuẩn” của Bergey (1974) và Nguyễn Lân Dũng (2006), chúng tôi đã xác định được tên của hai loài vi khuẩn gây bệnh trên cá chẽm giống như sau:

Chủng 1: Vibrio harveyi

Chủng 2: Vibrio alginolyticus

Đây là hai loài vi khuẩn Gram (-), tế bào có dạng hình qua ngắn, không có khả năng di động , trên môi trường tổng hợp NA + 2% NaCl cho một loại khuẩn lạc màu trắng (Hình 4.5), cho khuẩn lạc màu xanh của V. harveyi và màu vàng của V. alginolyticus  trên môi trường chọn lọc TCBS (Hình 4.6)

Kết quả này cũng trùng hợp với kết quả nghiên cứu của Hồ Thị Lê (2010) khi nghiên cứu thử nghiệm một số loài thảo dược trong phòng trị bệnh nhiễm khuẩn trên cá chẽm giống tại Thừa Thiên Huế. Tác giả đã kết luận rằng hai loài vi khuẩn V. harveyi và  V. alginolyticus là tác nhân chính gây bệnh lở loét, mòn vây, cụt đuôi trên cá chẽm giống.

So sánh với kết quả của các tác giả trong nước như: Đỗ Thị Hòa, trường Đại học Thủy sản Nha Trang đã nghiên cứu Vibrio spp  là tác nhân chính gây ra trên cá chẽm, trong đó V. alguillarum  chiếm 60 – 80%

Hình 4.5.  Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio trên

môi trường NA + 2% NaCl

Hình 4.6. Khuẩn lạc của vi khuẩn V. harveyi(A), V. alginolyticus (B)

trên môi trường TCBS

Theo Bùi Quang Tề (2002), các loài vi khuẩn Vibrio xuất hiện nhiều ở thủy vực nước lợ mặn tại các lồng nuôi cá biển. Chúng thường đóng vai trò là tác nhân cơ hội, khi tôm, cá sốc do môi trường biến đổi, hoặc bị nhiễm các tác nhân khác như virus, nấm, kí sinh sinh trùng. Khi sức đề kháng của động vật thủy sản giảm, các loài vi khuẩn Vibrionày có khả năng gây bệnh nặng, gây chết hàng loạt. Vi khuẩn V. harveyi thường phân bố trong nước biển, ven bờ…gây bệnh cho tôm cá nước mặn.

Theo Đỗ Thị Hòa (2004), sự khác nhau về sự khuếch tán màu sắc trên môi trường TCBS của hai chủng vi khuẩn này do khác nhau về khả năng lên men loại đường Saccarose. Vi khuẩn V. alginolyticus có khả năng lên men đường saccarose làm thay đổi màu sắc của môi trường từ màu xanh sang màu vàng (Hình 4.6B). Trong khi đó, vi khuẩn V. harveyi không có khả năng lên men loại đường này nên không làm thay đổi màu sắc của môi trường (Hình 4.6A).

           Chúng tôi đã tiến hành phân lập vi khuẩn và nuôi cấy thuần chủng nhiều lần nhưng vẫn không thấy có sự xuất hiện của các loài vi khuẩn khác.

4.3. Kết quả sàng lọc nồng độ ức chế và nồng độ tiêu diệt của Bokashi trầu trên 2 loài vi khuẩn V. harveyi  và V.alginolyticus 

Thí nghiệm thử khả năng kháng khuẩn của Bokashi trầu khác nhau được tiến hành trên cả hai loài  vi khuẩn V. harveyi  và V. alginolyticus  phân lập được

4.3.1. Kết quả thí nghiệm sàng lọc nồng độ ức chế

Kết quả theo dõi khả năng kháng khuẩn của các nồng độ Bokashi trầu khác nhau lên hai chủng vi khuẩn V. harveyi và V. alginolyticus sau  1 ngày, 2 ngày, 7 ngày  được thể hiện ở bảng 4.4 và bảng 4.5

Bảng 4.4. Kết quả sàng lọc nồng độ ức chế Bokashi trầu trên vi khuẩn V. harveyi

Nồng độ Bokashi trầu (ppm)

Nồng độ vi khuẩn (CFU/ml)

Sự phát triển của vi khuẩn/thời gian nuôi cấy

1 ngày

2 ngày

7 ngày

100000

106

-

-

-

10000

-

-

-

1000

-

-

-

100

-

-

-

10

+

+

+

0

+

+

+

Bảng 4.5. Kết quả sàng lọc nồng độ ức chếBokashi trầutrên vi khuẩn V. alginolyticus

Ghi chú: (+) Vi khuẩn phát triển               (-) Vi khuẩn không phát triển

Nồng độ Bokashi trầu (ppm)

Nồng độ vi khuẩn (CFU/ml)

Sự phát triển của vi khuẩn/thời gian nuôi cấy

1 ngày

2 ngày

7 ngày

100000

106

-

-

-

10000

-

-

-

1000

-

-

-

100

-

-

-

10

+

+

+

0

+

+

+

Ghi chú: (+) Vi khuẩn phát triển               (-) Vi khuẩn không phát triển

Qua bảng 4.4 và 4.5 ta thấy các nồng độ Bokashi trầu từ 100000 ppm, 10000 ppm, 1000ppm, 100 ppm đều có khả năng kháng khuẩn khuẩn. Sau 1 ngày, 2 ngày và 7 ngày không thấy sự phát triển trở lại cuả hai loài vi khuẩn V.harveyivàV.alginolyticus. Còn ở nồng độ 10 ppm vi khuẩn vẫn phát triển bình thường. Điều này cho thấy ở nồng độ 100  Bokashi trầu có khả năng ức chế hoàn toàn sự phát triển của 2 loài vi khuẩn V. harveyivàV. alginolyticus.

Theo nghiên cứu của Hồ Thị Lê  (2010), khi thử nghiệm một số loài thảo dược đối với hai loài vi khuẩn V. harveyivàV. alginolyticus phân lập được trên cá chẽm giống bị bệnh, kết quả cho thấy tỏi  có khả năng ức chế hoàn toàn sự phát triển của hai loài vi khuẩn này ở nồng độ 1000 ppm với đường kính vòng kháng khuẩn là 14.53 mm (bằng phương pháp đục lỗ thạch). Tuy nhiên, đối với Bokashi trầu nồng độ giảm thấp hơn 10 lần (100 ppm) so tỏi nhưng không thấy vi khuẩn phát triển trở lại.

Trong chế phẩm Bokashi trầu ngoài các alkoloid có khả năng kháng khuẩn như cadien, chavibetel,... còn có các nhóm vi sinh vật như: nhóm vi khuẩn quang hợp Rhodopseudomonas,  nhóm vi khuẩn Lactobacillus sp., Bacillus spp., nhóm xạ khuẩn  Strepptomyces spp., nấm men: Saccharomyces cerevisiae  và nhóm nấm sợi như Aspergillus sp. và Penicillium sp. có trong chế phẩm EM gốc nên có khả năng kháng khuẩn rất mạnh (Hiruga, 1980 ; Nguyễn Ngọc Phước, 2007). Các loại vi sinh này sẽ tự sản sinh ra các yếu tố dinh dưỡng, tự tạo kháng chất giúp vật nuôi tiêu diệt vi khuẩn độc hại, kích thích vật nuôi phát triển tốt (Phạm Danh, 2006). Các chủng Strepptomyces spp., Aspergillus sp.  và Penicillium sp. trong quá trình phát triển sẽ sản xuất các loại kháng sinh có khả năng tiêu diệt các loại vi khuẩn Gram (-).Sự có mặt của nhóm vi khuẩn lên men lactic như Lactobacillus sp., Bacillus spp., sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn Vibrio spp. Ngoài ra, quá trình lên men của các chủng vi khuẩn này sẽ tạo ra axit lactic là dung môi thích hợp cho việc chiết xuất các loại kháng sinh từ lá trầu. Còn trong tỏi có chứa chất kháng sinh alixin C6H10OS2, có tác dụng diệt vi khuẩn rất mạnh (Theo Đỗ Tất Lợi, 2004) nhưng lại không có sự tác dụng tổng hợp của các thành phần trong chế phẩm EM như Bokashi trầu.

Vì vậy từ kết quả trên chúng tôi chọn nồng độ 100  ppm cho bước sàng lọc tiếp theo.

4.3.2. Kết quả thử nghiệm nồng độ ức chế vi khuẩn của Bokashi trầu

Sau khi có kết quả của thí nghiệm sàng lọc các nồng độ Bokashi trầu, chúng tôi tiến hành pha loãng nồng độ Bokashi ở 100 ppmgiảm 2 lần. Kết quả thử nghiệm nồng độ ức chế vi khuẩn của Bokashi trầu trên hai loài vi khuẩn V. harveyi và V. alginolyticus được thể hiện ở bảng 4.6 và 4.7

Bảng 4.6.Khả năng ức chế của Bokashi trầu lên vi khuẩn V. harveyi

Nồng độ Bokashi trầu (ppm)

Nồng độ vi khuẩn (CFU/ml)

Sự phát triển của vi khuẩn/thời gian nuôi cấy

1 ngày

2 ngày

7 ngày

100

106

-

-

-

50

-

-

-

25

-

-

+

12,5

+

+

+

0

+

+

+

Ghi chú: (+) Vi khuẩn phát triển               (-) Vi khuẩn không phát triển

Bảng 4.7.Khả năng ức chế của Bokashi trầu lên vi khuẩn V. alginolyticus

Nồng độ Bokashi trầu (ppm)

Nồng độ vi khuẩn  thí nghiệm (CFU/ml)

Sự phát triển của vi khuẩn/thời gian nuôi cấy

1 ngày

2 ngày

7 ngày

100

106

-

-

-

50

-

-

-

25

-

+

+

12,5

+

+

+

0

+

+

+

Ghi chú: (+) Vi khuẩn phát triển               (-) Vi khuẩn không phát triển

Từ bảng 4.6 và 4.7 chúng tôi nhận thấy rằng chế phẩm Bokashi trầu có thể ức chế được hai chủng vi khuẩn này ở nồng độ 25 ppm sau 1 ngày nuôi cấy, tuy nhiên đối với vi khuẩn V.harveyi đã phát triển trở lại vào ngày thứ 7. Còn vi khuẩn V.alginolyticusthì chỉ sau 2 ngày. Điều này cho thấy ở nồng độ 50 ppm,100 ppm Bokashi trầu có thể tiêu diệt được vi khuẩn và không thấy có hiện tượng phát triển trở lại của hai loài vi khuẩn này.

Qua đó thấy được khả năng ức chế của Bokashi trầu lên hai loài vi khuẩn  ở nồng độ 25 ppm.

4.3.3. Kết quả thử nghiệm khả năng tiêu diệt vi khuẩn của Bokashi trầu

 Khả năng tiêu diệt vi khuẩn của Bokashi trầu trên hai loài vi khuẩn V. harveyi và V. alginolyticus được thể hiện ở bảng 4.8 và 4.9

Bảng 4.8. Khả năng tiêu diệt vi khuẩn V. harveyi của Bokashi trầu

Nồng độ Bokashi trầu (ppm)

Nồng độ vi khuẩn  thí nghiệm (CFU/ml)

Sự phát triển của vi khuẩn/thời gian ngâm

15 phút

30 phút

1 giờ

24 giờ

100

106

-

-

-

-

50

-

-

-

-

25

+

+

+

-

12,5

+

+

+

+

0

+

+

+

+

Ghi chú: (+) Vi khuẩn phát triển               (-) Vi khuẩn không phát triển

Bảng 4.9. Khả năng tiêu diệt vi khuẩn V. alginolyticus của Bokashi trầu

Nồng độ Bokashi trầu (ppm)

Nồng độ vi khuẩn  thí nghiệm (CFU/ml)

Sự phát triển của vi khuẩn/thời gian ngâm

15 phút

30 phút

1 giờ

24 giờ

100

106

-

-

-

-

50

-

-

-

-

25

+

+

+

-

12,5

+

+

+

+

0

+

+

+

+

Ghi chú: (+) Vi khuẩn phát triển               (-) Vi khuẩn không phát triển

Từ hai bảng 4.8 và 4.9 chúng tôi có nhận xét:Khi nồng độ Bokashi trầu tăng dần thì khả năng tiêu diệt vi khuẩn cũng tăng lên. Sau 1 giờ vi khuẩn vẫn phát triển ở nồng độ 25 ppm nhưng sau 24 giờ Bokashi trầu ức chế  được cả hai loài vi khuẩn trên. Ở nồng độ 50 ppm hoặc cao hơn, Bokashi trầu tiêu diệt V. harveyi và V. alginolyticus chỉ sau 1 giờ.

Bảng 4.10.Các nồng độ ức chế và tiêu diệt vi khuẩn của Bokashi trầu

Như vậy, Bokashi trầu có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn ở các nồng độ khác nhau. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.10

Chủng vi khuẩn

Bokashi trầu

Nồng độ ức chế tối thiểu

Nồng độ tiêu diệt tối thiểu

V. harveyi

25 ppm

50 ppm

V. alginolyticus

25 ppm

50 ppm

Nhiều nghiên cứu đã xác nhận lá trầu có tác dụng kháng sinh mạnh. Theo Võ Văn Chi (2000),  chất kháng sinh chiết xuất từ lá trầu diệt được nhiều loài vi khuẩn gây bệnh ở người, các hoạt chất trong lá trầu có tác dụng kháng sinh rất mạnh đối với các loại vi trùng tụ cầu, B. subtilis và trực trùng E. coli, lá trầu gồm chủ yếu là hai phenol: Betel – phenol là đồng phân của eugenol và chavicol kèm theo nhiều hợp chất phenolic khác, chúng có tác dụng kháng sinh rất mạnh đối với các loại vi khuẩn, nấm, và kí sinh trùng (Võ Văn Chi, 2000; Đỗ Thị Hòa, 2004).

Khi nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá trầu và Bokashi trầu lên hai loại vi khuẩn V.  parahaemolyticus và A. hydrophyla, Nguyễn Ngọc Phước (2007) đã kết luận với nồng độ 2,5 ppm Bokashi trầu có khả năng ức chế hoàn toàn hai loại vi khuẩn này. Sự kết hợp lá trầu và chế phẩm EM5 cho kết quả kháng khuẩn mạnh không những do các loại alkaloid có trong lá trầu mà còn do sự tạo thành β – carotenoid trong quá trình lên men rỉ mật của nấm Sacharomyces có trong thành phần EM. β – carotenoid là chất tiền sinh trưởng, ngoài tác dụng kích thích sinh trưởng cho động vật giáp xác còn có tác dụng cung cấp chất dinh dưỡng cho các loại xạ khuẩn, nấm sợi, vi khuẩn lên men lactic hoạt động, từ đó nó làm tăng hoạt tính kháng khuẩn của Bokashi trầu (Nguyễn Ngọc Phước, 2007).  Từ  những kết quả bước đầu cho thấy, Bokashi trầu có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn  Vibrio spp rất mạnh.

Theo nghiên cứu của Trần Quang Khánh Vân (2010), tác dụng của Bokashi trầu sẽ giảm dần theo thời gian bảo quản, tác dụng tốt nhất trong khoảng thời gian 1 tháng và sau đó giảm dần. Vì vậy, trong thực tế sản xuất cũng như khi sử dụng Bokashi trầu cần phải chú ý để hiệu quả sử dụng Bokashi trầu để có tác dụng tốt nhất trong phòng và trị bệnh.

Như vậy Bokashi trầu có nồng độ ức chế và tiêu diệt hai loài vi khuẩn V. harveyi và V. alginolyticus ở nồng độ không quá cao. Cụ thể, nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu của Bokashi trầu với hai loài vi khuẩn là 25 ppm và nồng độ tiêu diệt vi khuẩn tối thiểu là 50 ppm.

PHẦN 5

 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. Kết luận

- Kết quả phân lập, định danh các mẫu bệnh cá chẽm đã xác định được hai loài vi khuẩn V . harveyi và V. alginolyticus.  

- Nồng độ ức chế tối thiểu của Bokashi trầu đối với vi khuẩn V . harveyi và   V. alginolyticus  là 25 ppm.

- Nồng  tiêu diệt tối thiểu của Bokashi trầu với hai loài vi khuẩn V. harveyi và V. alginolyticus là 50 ppm.

5.2. Kiến nghị

            - Cần nghiên cứu sâu về tác dụng của Bokashi trầu trên các đối tượng cá nước mặn, lợ khác nhau để ứng dụng rộng rãi Bokashi trong phòng và trị bệnh

- Cần thử nghiệm các phương pháp sàng lọc nồng độ khác nhau trên các loại thảo dược để đưa ra phương pháp phòng và trị bệnh có hiệu quả nhất trên các đối tượng nuôi thủy sản.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu trong nước

[1]. Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, 1999.

[2]. Vũ Văn Chuyên và cộng sự, Địa lý các họ cây Việt Nam, NXB Khoa học kỹ thuật, 1987.

[3]. Trần Đức Diễn, “Điều tra tình hình dịch bệnh trên cá chẽm nuôi tại Cam Ranh – Khánh Hòa”, 2008.

[4]. Nguyễn Xuân Dũng và cộng tác viên, Thành phần hóa học tinh dầu không, Tạp chí dược học số 5, 1989.

[5]. Trần Ngọc Hải và cộng sự, Giáo trình kỹ thuật sản xuất giống và nuôi cá biển. Trường Đại học Cần Thơ, 2006.

[6].Đỗ Thị Hòa và cộng tác viên, Bệnh học thủy sản, NXB Nông Nghiệp  Hà Nội, 2004.

[7]. Hồ Thị Lê, Nghiên cứu thử nghiệm một số loài thảo dược trong phòng trị bệnh nhiễm khuẩn trên cá chẽm giống (Lates calcarifer, Bloch,1790) nuôi tại xã Hải Dương – huyện Hương Trà – tỉnh Thừa Thiên Huế, 2010.

[8]. Nguyễn Thị Huế Linh, 2006. Bài giảng bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản

[9]. Đỗ Tất Lợi, Cây và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 1985.

[10]. Nguyễn Ngọc Phước và cộng tác viên, Sử dụng thảo dược và chế phẩm từ thảo dược trong điều trị bệnh vi khuẩn cho động vật thủy sản, Kỷ yếu Khoa học Công nghệ, Liên hiệp khoa học Kỹ thuật Việt Nam, Hà nội, 2007.

[11]. Nguyễn Ngọc Phước,   Nghiên cứu sử dụng các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên (lá trầu và tỏi) để phòng trị bệnh trên động vật thủy sản, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học và vông nghệ cấp Bộ, 2010.

[12]. Nguyễn Thanh Phương và cộng tác viên, Giáo trình nuôi trồng thủy sản. Trường Đại học Cần Thơ, 2009.

[13]. Mai Văn Tài, Điều tra đánh giá hiện trạng các loại thuốc và hóa chất dùng trong nuôi trồng thủy sản nhằm đề xuất các biện pháp quản lý, 2004.

[14]. Bùi Quang Tề và cộng tác viên, Kết quả nghiên cứu chế phẩm VTS1 4 – T, VTS1 – C tách chiết từ thảo dược phòng trị bệnh cho tôm sú và cá tra, 2004.

[15].Bùi Quang Tề và cộng tác viên, Dự thảo danh mục các chất thay thế hóa chất, kháng sinh và chế phẩm sinh học cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản, 2002.

[16]. Nguyễn Thị Vân Thái, Xây dựng bài thuốc y học cổ truyền ứng dụng trong phòng và chữa bệnh cho tôm cá. Bệnh viện Y học cổ truyền TW, Tuyển tập Hội thảo toàn quốc về nghiên cứu và ứng dụng khoa học công nghệ trong NTTS (22  –  23/12/2004 tại Vũng Tàu), NXB Nông Nghiệp, 2004.

[17]. Nguyễn Thị Vân Thái và cộng tác viên, Bàn về tiềm năng phòng và chữa bệnh nhiễm khuẩn  bằng kháng sinh thảo mộc  trong nuôi trồng thuỷ sản, 2006.

[18]. Phan Xuân Thanh và cộng tác viên, Khả năng sử dụng các hoạt chất sinh học thay thế các hóa chất độc và kháng sinh trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản, Tuyển tập nghề cá sông Cửu Long, 2003.

[19]. Phạm Hùng Việt, Sắc ký khí, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, 2005.

[20]. Trần Quang Khánh Vân, Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2010.

[21]. Báo cáo tình hình cá chết tại Thừa Thiên Huế, 2010.

[22]. Tạp chí khoa học – công nghệ thủy sản – số 02/2008, trường Đại học Thủy sản Nha Trang.

Tài liệu nước ngoài

[23].Kobori and Tanabe, Atimicrobial activity of Hibokitiol for methicilin resistant staphylococcus aureus. 2 (in Japanese). Med. Examinat. 1639-1642 ogen of juvenile farmed barramundi, Lates calcarifer Bloch, 1993.

[24]. Cheong L, Status of knowledge on farming of Seabass (Lates calcarifer) in South East Asia, 1989.

[25]. Ruangpan  T, P.Haffner, C.Mal Fondet &M.Weppe. Vibrio damsela as a pathogenic agent causing mortalities in cultured seabass (Lates calcarifer) Bull Eur Pathol 14 (4), 1994, 117 – 119

Các website

[26]. http://www.fistenet.gov.vn

[27]. http://www.tapchicongsan.org.vn

[28]. http://www.hids.hochiminhcity.gov.vn

[29]. http://www ftp.fao.org

[30]. http://www.ria1.mofi.gov.vn

[31]. http://www.vietlinh.com.vn

[32]. http://www.fishtenet.gov.vn

[33]. http://www.en.wikipedia.org

PHỤ LỤC

Pha loãng nồng độ

Bokashi trầu