Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography, HPLC) là kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp các hợp chất trong hóa phân tích và hóa sinh để nhận dạng, định lượng và làm sạch các thành phần của hỗn hợp. Ví dụ tách và định lượng thuốc kích thích (ví dụ steroid) trong mẫu nước tiểu hoặc xác định hàm lượng vitamin D trong huyết thanh.

HPLC điển hình sử dụng các dạng pha tĩnh (chất hấp thụ) khác nhau trong cột, bơm đẩy pha động và các thành phần mẫu qua cột, và đầu dò có khả năng cung cấp thời gian lưu đặc trưng của các thành phần mẫu và diện tích phản ánh hàm lượng chất phân tích đi qua đầu dò. Thời gian lưu của chất phân tích phụ thuộc vào cường độ tương tác của chất đó với pha tĩnh, thành phần và lưu lượng của pha động và kích thước cột. HPLC là dạng sắc ký lỏng sử dụng các cột kích cỡ nhỏ (thường có chiều dài 250 mm hoặc ngắn hơn, đường kính trong 4,6 mm hoặc nhỏ hơn) và áp suất pha động cao hơn so với sắc ký lỏng thông thường.

Các hạt hấp thụ có kích thước càng nhỏ thì tỉ trọng cột càng tăng. Cột các hạt nhỏ này có khả năng tách tốt hơn so với cột sắc ký thông thường.

Quá trình sắc ký

Cho một thể tích nhỏ mẫu cần tách và phân tích vào dòng pha động đi qua cột. Các thành phần của mẫu di chuyển qua cột với những vận tốc khác nhau, là hàm của tương tác hóa, lý với pha tĩnh. Tốc độ của mỗi thành phần phụ thuộc vào bản chất hóa học của nó, bản chất của pha tĩnh (cột) và thành phần pha động. Thời điểm chất phân tích thoát ra khỏi cột gọi là thời gian lưu. Thời gian lưu được đo trong những điều kiện nhất định được xem là đặc trưng nhận dạng chất phân tích. Sử dụng vật liệu nhồi cột có kích thước hạt càng nhỏ đòi hỏi áp suất vận hành càng lớn và thường cải thiện độ phân giải sắc ký (cụ thể mức độ tách giữa các chất phân tích thoát ra khỏi cột nối tiếp nhau). Pha động thường là hỗn hợp của nước với các dung môi hữu cơ (phổ biến nhất là axetonitril và metanol). Một số kỹ thuật HPLC dùng pha động không có nước. Thành phần của pha động có thể chứa chất đệm, axit (ví dụ axit focmic, photphoric, trifloaxetic) hoặc muối để hỗ trợ việc tách các thành phần mẫu. Thành phần của pha động có thể được giữ không đổi (isocratic) hoặc biến đổi (gradient) trong quá trình phân tích. Tách isocratic thường hiệu quả với mẫu mà ái lực với pha tĩnh của các thành phần không khác nhau nhiều.

Trong tách gradient thành phần pha động thường biến đổi từ cường độ rửa giải thấp đến cao. Cường độ rửa giải của pha động phản ánh qua thời gian lưu của chất phân tích, cường độ rửa giải cao thì rửa giải nhanh (tương ứng với thời gian lưu ngắn). Tách gradient điển hình trong sắc ký đảo pha có thể bắt đầu với axetonitril nồng độ 5% (trong nước hoặc dung dịch đệm) và tăng tuyến tính tới nồng độ 95% trong 5 – 25 phút. Thành phần pha động có thể không đổi trong một khoảng thời gian, ví dụ axetonitril nồng độ 5% có thể được giữ từ 1 – 3 phút trước khi tăng tuyến tính lên 95%.

Lựa chọn các thành phần của pha động, chất phụ gia (như muối hoặc axit) và điều kiện gradient phụ thuộc vào bản chất cột và thành phần mẫu. Cần tiến hành các đợt chạy thử với mẫu để tìm ra phương pháp HPLC tách tốt nhất.

Sơ đồ hệ thống HPLC

Ứng dụng

-          Phân tích y sinh: theo dõi thuốc điều trị (ví dụ nồng độ theophylline cyclosporine sau cấy ghép), xét nghiệm chất chuyển hóa (ví dụ vitamin, chất dẫn truyền thần kinh như catecholamines), xác định đặc điểm chuyển hoá (ví dụ amino axit, purine and pyrimidine trong bệnh di truyền), xét nghiệm protein, enzyme

-          Phân tích tư pháp: phân tích thuốc lạm dụng (như amphetamine, heroin, cocain, LSD), phân tích mẫu độc chất, anion, thuốc nhuộm

-          Phân tích môi trường: chất phân tích hữu cơ (hydrocarbon thơm PAH, phenol, thuốc trừ sâu, linear alkylbenzenesulphonate, anion hữu cơ), chất phân tích vô cơ (ion vô cơ, kim loại)

-          Ứng dụng trong ngành thực phẩm, dược

Nguồn tham khảo: