Đọc truyện gen thuc vat

♥ AzTruyen.Top - Trang đọc truyện hoàn toàn miễn phí!

gen thuc vat

Trước Sau

Màu nền

Font chữ

Font size

Chiều cao dòng

1.Nêu các thành phần sau của phản ứng PCR gồm: ADN khuôn; mồi; dNTPs; ezym tổng hợp ADN và dung dịch đệm PCR.

* Khái niệm

PCR được viết tắt của cụm từ tiếng Anh: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng Trùng Phân, Phản ứng chuỗi Polymerase, hay phản ứng PCR). Bản chất của PCR đó là sự tổng hợp nhân tạo ra các đoạn ADN mới

* Các thành phần của kỹ thuật PCR

Các thành phần chính của PCR gồm: ADN khuôn, dNTP, Mồi (primer), enzym polymerase (Taq), MgCl2 và đệm PCR; phản ứng được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt, hay còn gọi là máy PCR.

- ADN khuôn

ADN khuôn (DNA template) hay còn gọi là ADN mục tiêu được sử dụng làm cái khuôn để các mồi PCR gắn vào vị trí bổ sung với nó, sau đó với sự tham gia của các thành phần cần thiết, phản ứng tổng hợp sẽ diễn ra tạo lên một đoạn ADN mới giống hệt đoạn ADN nằm giữa hai vị trí gắn mồi.

Từ chu kỳ thứ hai trở đi, ngoài ADN khuôn ban đầu, những đoạn ADN vừa được tổng hợp cũng được sử dụng làm khuôn cho những chu kỳ tổng hợp tiếp theo.

Lượng ADN khuôn rất nhỏ khoảng từ 20ng đến 100ng. Do lượng ADN cần thiết nhỏ như vậy, nên khi chuẩn bị ADN khuôn phải hết sức chú ý tránh bị lẫn ADN từ các nguồn khác và cần phải có ADN khuôn với độ nguyên vẹn cao.

- Mồi PCR

Mồi là một đoạn oligonucleotít ngắn, có chiều dài khoảng từ 6 (mồi hexanucleotít) đến 70 nucleotít, những mồi ngẫu nhiên (mồi RAPD) có chiều dài khoảng 10 nucleotít và đa số các mồi PCR có chiều dài khoảng 20 đến 30 nucleotít.

+ Thiết kế mồi

Khi thiết kế mồi, người ta thường quan tâm sao cho không có sự bổ sung giữa các bazơ trong cùng một mồi và giữa các mồi. Vì phản ứng tổng hợp được bắt đầu từ đuôi 3’ của mồi;

Do vậy để nâng cao hiệu quả gắn mồi và tính đặc hiệu của phản ứng, người ta thường quan tâm đến việc thiết kế sao cho đuôi 3’ của chúng là các bazơ G hoặc C để tạo ra sự bắt cặp chắc hơn và đặc hiệu hơn so với cặp A và T.

+ Nhiệt độ gắn mồi

Trong PCR phải tìm được nhiệt độ thích hợp nhất cho mồi gắn vào ADN khuôn. Để xác định nhiệt độ gắn mồi tương đối ban đầu, người ta đã dựa trên những công thức toán khác nhau.

· Đối với những mồi có chiều dài ≤ 20 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi được tính theo công thức sau:

Tm ( oC) = {2 x (A + T) + 4 x (G + C)}

VD: một mồi có trình tự nucleotide như sau: CAG CAA ATA TCT GTC CTT AC, nhiệt độ gắn mồi tương đối sẽ là: Tm = 2 x 12 + 4 x 8 = 56 oC.

· Đối với những mồi có chiều dài từ 20 đến 35 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi được tính theo công thức:

Tm ( oC) = 22 + 1,46 x {[2 x (C +G) + ( A + T)]}

· Đối với những mồi có chiều dài từ 35 đến 70 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi được tính theo công thức:

Tm ( oC) = 81,5 + 16.6 log10C+ + 0,41 (% của G + C) – 600/L.

C+ là nồng độ của cation hoá trị một (Na+), tính theo nồng độ của phân tử; L là chiều dài mồi.

Trong thực tế nhiệt độ gắn mồi có thể dao động từ 30C đến 150C so với nhiệt độ tính toán được từ các công thức. Các công thức nêu trên chỉ để tham khảo; nhiệt độ gắn mồi tối ưu được rút ra qua thí nghiệm cụ thể.

+ Nồng độ mồi

Nồng độ mồi có thể được sử dụng vào khoảng 100 đến 500 nM. Tuy nhiên nồng độ cụ thể phụ thuộc vào từng thí nghiệm và mục đích nghiên cứu. Nếu nồng độ mồi quá thấp sẽ không đủ cho phản ứng và nồng quá cao có thể dẫn tới sai lệch kết quả.

+ Thời gian gắn mồi

Thời gian gắn mồi vào khuôn thường dao động trong khoảng 30 đến 60 giây. Nếu thời gian gắn mồi lâu sẽ gây ra sai lệch kết quả phản ứng do sự gắn mồi không đặc hiệu, hơn nữa sẽ kéo dài thời gian phản ứng làm suy giảm sự hoạt động của enzym Taq.

*dNTP - deoxyribonucleotides: dATP, dCTP, dGTP and dTTP

- dNTP (A, T, G, C là những “viên gạch” để xây dựng lên sợi ADN mới trong phản ứng chuỗi. Nồng độ của dNTP thường sử dụng cho mỗi phản ứng là 200mM. Nếu nồng độ dNTP quá cao nó sẽ liên kết với Mg2+, một ion rất cần cho sự hoạt động của enzym tổng hợp, vì vậy mà sẽ ảnh hưởng tới phản ứng tổng hợp.

- dNTP rất nhậy cảm với sự thay đổi nhiệt độ, cứ sau 35 chu kỳ của PCR thì dNTP hầu như đã bị suy giảm; trong một môi trường axít nó sẽ chuyển hoá nhanh thành dNDP và dNMP. Do vậy mà dNTP là chất không bền, đặc biệt sử dụng cho PCR.

*Enzym tổng hợp ADN.

Là một thành phần quan trọng của phản ứng PCR. Trong điều kiện thích hợp cùng với các thành phần cần thiết khác, enzym hoạt động tổng hợp nên ADN mới. Nồng độ sử dụng enzym phụ thuộc vào mỗi loại enzym và thuộc tính của nó; có thể sử dụng từ 1 đến 2 đơn vị enzym sẽ cho hiệu quả tốt nhất với PCR có thể tích 25ml.

Nếu quá nhiều enzym có thể sẽ làm tăng nồng độ glycerol trong dung dịch phản ứng, dẫn tới quá trình tổng hợp không đồng đều giữa các vị trí và tạo ra hình ảnh điện di không rõ nét. Ngược lại, nếu quá ít sẽ thiếu enzym và kết quả nhận được là sản phẩn tổng hợp không đầy đủ.

*Dung dịch đệm PCR

Dung dịch đệm chung nhất của PCR bao gồm các thành phần KCl, MgCl2 và Tris. Muối KCl góp phần làm tăng hiệu quả của phản ứng, thông thường những mồi cho sản phẩm PCR với kích thước lớn hơn thì hoạt động tốt hơn trong môi trường có nồng độ muối thấp hơn và ngựơc lại những đôi mồi cho sản phẩm PCR ngắn hơn sẽ hoạt động tốt hơn trong môi trường có nồng độ muối cao hơn.

MgCl2 là nhân tố cần thiết để enzym Taq hoạt động, nếu nồng độ MgCl2 thấp, sẽ ức chế sự hoạt động của enzym Taq, tuy nhiên nếu nồng độ quá cao sẽ cho kết quả PCR không đặc hiệu. Tris có vai trò giữ cho pH dung dịch ổn định, sự thay đổi nồng độ của Tris không ảnh hưởng nhiều đến kết quả phản ứng PCR.

*Thể tích phản ứng:

Thể tích không ảnh hưởng tới kết qủa của phản ứng, nếu chúng ta sử dụng ống PCR nhỏ có thành mỏng và sử dụng loại máy PCR không cần dầu để chống bay hơi dung dịch. Thể tích phản ứng có thể được điều chỉnh từ 5ml đến 100ml, tuy nhiên nếu với cùng lượng ADN khuôn, thể tích PCR nhỏ sẽ cho nồng độ sản phẩm lớn hơn so với thể tích PCR lớn. 2.7. Chu kỳ phản ứng:

Các thí nghiệm cho thấy số chu kỳ cần áp dụng cho một phản ứng từ 25 đến 45 là vừa đủ. Nếu tiếp tục tăng số chu kỳ, thậm trí lên tới 60 chu kỳ thì sản phẩm PCR có tăng lên nhưng không đáng kể.

*Chu kỳ phản ứng:

4. Các nhà khoa học đã khai thác đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) để phục vụ cho mục đính chuyển gen như thế nào?.

A. tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh khối u ở thực vật sống trong đất, nó được sử dụng làm vectơ để chuyển các gen (gen mong muốn) nhằm tạo ra những thực vật mang gen có các đặc tính mong muốn.

Khi xâm nhiễm, vi khuẩn A. tumefaciens chuyển một đoạn T-ADN nằm trên plasmid gây khối u (Ti- plasmid) của nó vào nhân của những tế bào thực vật. Đoạn T-ADN gắn vào hệ gen thực vật và hoạt động gây ra khối u ở nơi bị nhiễm. để tạo chất dinh dưỡng nuôi vi khuẩn. Đoạn T-ADN được thay thế bằng gen mong muốn và thông qua vi khuẩn được chuyển vào cơ thể tạo cây mang gen

- Chuyển gen vào thực vật

Ti-plasmid mang gen mong muốn đựơc biến nạp trở lại vi khuẩn. Sau đó vi khuẩn mang Ti-plasmid chứa gen mong muốn được nuôi cấy chung với mô thực vật, trong quá trình đó vi khuẩn xâm nhập vào mô và các gen vào hệ genom của các tế bào mô. Những mô đã đựơc chuyển gen đựơc tái sinh thành cây và sau một số quá trình chọn lọc, sẽ chọn được những cây mang gen và biểu hiện các đặc tính mong muốn (hình dưới).

6. Hãy cho biết tại sao khi thiết kế mồi người ta lại rất quan tâm đến việc gắn các nucleotide loại G và C vào đầu 3' (ba phẩy) chúng. Tính nhiệt độ gắn mồi tương đối của mồi sau: 5'-ATCGGATCCGCTAGGCTCG-3'.

- Thiết kế mồi

do vậy để nâng cao hiệu quả gắn mồi và tính đặc hiệu của phản ứng, người ta thường quan tâm đến việc thiết kế sao cho đuôi 3’ của chúng là các bazơ G hoặc C để tạo ra sự bắt cặp chắc hơn và đặc hiệu hơn so với cặp A và T.

- Nhiệt độ gắn mồi

*Đối với những mồi có chiều dài ≤ 20 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi được tính theo công thức sau:

Tm ( oC) = {2 x (A + T) + 4 x (G + C)} = {2 x (3 + 4) + 4 x (6 + 6)}= 62oC

7. Trình bày các nội dung sau: đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens); các gen và cây trồng sử dụng trong chuyển gen; véctơ đơn; véctơ nhị phân và chuyển gen vào thực vật.

* Đặc điểm:

* Các gen và cây trồng đang được sử dụng trong chuyển gen

Một số gen quan trọng đang được sử dụng trong nghiên cứu để tạo ra cây trồng chuyển gen đó là: Các gen kháng thuốc diệt cỏ và kháng bệnh nấm; các gen CryI(a, c, b, d) kháng sâu; GNA kháng rầy, Xa-21 kháng bệnh bạc lá; gen õ- catoten (tiền chất vitamin A); gen anti-ACO gen quả chín chậm và hoa lâu tàn; gen vỏ bọc (protein coat) kháng đốm vàng; gen chitinase kháng nấm, các gen P5CS, OAT, TPS, nhaA, HAL chịu hạn và mặn, các gen CgS, SA tăng hàm lượng axit amin, gen replicase kháng bệnh đốm vòng, gen bar kháng thuốc trừ cỏ.

Các cây trồng được chuyển gen như: lúa, ngô, đậu tương, bông, cải dầu, cải bắp, hoa, thuốc lá (chuyển gen kháng sâu, thuốc trừ cỏ…); lúa (chuyển gen kháng nấm, thuốc trừ cỏ,vitamin…); hoa, quả (chuyển gen lâu tàn); cây lâm nghiệp (chuyển gen kháng sâu, mã hóa tinh bột mạch vòng)

* Thiết kế vectơ chuyển gen

+ Vectơ đơn: Loại bỏ đoạn T-ADN ở Ti-plasmid của vi khuẩn, gắn hệ thống gen cần chuyển vào vị trí đã loại bỏ của Ti-plasmid. Những véctơ chỉ sử dụng một plasmid thì được gọi là véctơ đơn.

+ Véctơ nhị phân: hệ thống gen cần chuyển và vùng vir (vùng chứa gen độc tính) nằm trên các plasmid khác nhau. Ưu điểm của véctơ nhị phân là dễ dàng thiết kế, dễ nhân dòng và có thể gắn được vào chúng hệ thống gen chuyển có kích thước lớn.

* Chuyển gen vào thực vật

10. Có các hoá chất để chay PCR với các nồng độ gốc sau: ADN khuôn 10ng/ul; MgCl2 (25mM/ul); 10X Buffer; dNTP(1.25uM/ul); Taq (1unit/ul); Primers (5uM/ul), hãy tính lượng các hợp chất và nước cất cần cho 1 phản ứng có thể tích 20ul để được nồng độ cuối cùng là MgCl2 (50mM); 1X Buffer; dNTP(2,5uM); Taq (1unit); Primers (5uM); ADN khuôn 30ng

Thành phần

Nồng độ gốc

Nồng độ cần

Thể tích cần

Buffer

10X

2 µl

dNTP

1,25µM/µl

2,5 µM/µl

2 µl

Primer

5 µM/µl

1 µl

MgCl2

25mM/µl

50mM/µl

2 µl

Taq

1 µ/µl

1 µl

DNA

10ng/µl

30 ng/µl

3 µl

H2O

9 µl

Tổng 20 µl

11. Trình bày khái niệm và những đặc điểm cơ bản của 4 loại chỉ thị ADN chủ yếu: RAPD, AFLP, SSR, RFLP.

* Kỹ thuật RAPD

RAPD là viết tắt của cụm từ tiếng Anh: Randomly Amplified Polymorphic DNA (Đa hình ADN được nhân bản ngẫu nhiên). Nó là kỹ thuật được xây dựng dựa trên nguyên lý PCR, với những mồi được thiết kế ngẫu nhiên có chiều dài khoảng 10 nucleotide.

Trong phản ứng, các mồi RAPD gắn ngẫu nhiên vào ADN khuôn ở bất kỳ vị trí nào mà có trình tự bổ sung với nó.

Phản ứng sau đó xảy ra với sự tham gia của enzym Taq, dNTP và các thành phần khác. Kỹ thuật này chỉ sử dụng một lượng nhỏ ADN khuôn (khoảng 25ng).

Sản phẩm PCR được điện di trong gel agarose và phát hiện bằng cách nhuộm với dung dịch ethydiumbromide, kích thước sản phẩm có chiều dài từ 200 bp đến 2000bp. Về cơ bản chỉ thị RALD là chỉ thị trội , nghĩa là chỉ thị này không phân biệt được giữa những cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử trong quần thê F2.

RAPD là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, không mất nhiều thời gian, ít tốn kém. Kỹ thuật này rất phù hợp cho phân tích đa dạng di truyền và lập bản đồ gen sử dụng quần thể RIL (Recombinant Inbred Line). Hạn chế lớn nhất của kỹ thuật RAPD đó là nó rất nhậy cảm với nhiều yếu tố như: các thành phần tham gia phản ứng và đặc biệt là nhiệt độ gắn mồi, vì yếu tố gắn mồi mà có thể có hai kết quả khác nhau với cùng một thí nghiệm sử dụng hai máy PCR khác nhau. Để hạn chế nhược điểm này, cần phải tuân thủ nghiêm ngặt các điều kiện thí nghiệm và phải tiến hành đồng bộ giữa các lần thí nghiệm.

* Kỹ thuật SSR (Single Sequence Repeat hay Microsatelite)

Khi nghiên cứu genom của một số sinh vật người ta đã phát hiện ra những đoạn ADN có chiều dài khác nhau phân bố một cách ngẫu nhiên mà trình tự của nó bao gồm các nhóm nucleotide giống nhau nhắc lại nhiều lần; các nhóm này thưòng có số lượng không vượt quá 5 nucleotide ví dụ như (TG)n hoặc (AAT)n.

Ở lúa các nhóm nucleotide đã phát hiện được gồm GA, GT, CAT, CTT. Những đoạn ADN lặp lại như vậy được gọi là Microsatelite hay còn có các tên khác như: SSLPs (single sequence length polymorphisms), SSRs (simple sequence repeats).

Các đoạn ADN nhắc lại này có trình tự hai đầu rất đặc trưng cho mỗi đoạn; bởi vậy mà trình tự đặc trưng ở hai đầu của đoạn nhắc lại này đã được sử dụng để thiết kế mồi cho PCR. Do có sự khác nhau về chiều dài giữa các đoạn nhắc lại, bởi vậy mà kỹ thuật nhận dạng ADN Microsatelite rất phù hợp trong nghiên cứu đa hình;

lập bản đồ và phân lập gen. Cũng giống như kỹ thuật RAPD, kỹ thuật SSR đơn giảm, thuận tiện, không tốn kém; mặt khác Microsatelites là chỉ thị đồng trội nên nó được sử dụng để phát hiện cá thể dị hợp tử và lập bản đồ gen sử dụng quần thể F2.

* Kỹ thuật AFLP

Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphim) được phát triển dựa trên nguyên lý PCR để nhân bản những đoạn ADN đã được phân cắt bởi enzym giới hạn (restriction enzyme). Điểm cơ bản nhất của kỹ thuật này đó là sự thiết kế mồi PCR đặc trưng.

Qui trình thiết kế mồi PCR được tiến hành như sau: trước tiên, ADN tổng số được cắt bởi các enzym giới hạn; hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng hai enzym EcoRI (enzym nhận biết 6 nucleotit) và MseI (enzym nhận biết 4 nucleotit). Khi sử lý với enzym giới hạn, ADN sẽ bị cắt thành vô số mảnh có kích thước khác nhau mà mỗi mảnh ta đều biết được trình tự nucleotide của chúng ở hai đầu cắt.

Dựa vào trình tự đã biết ở đầu cắt, ta thiết kế các đoạn gắn (adapter) và gắn chúng vào mỗi đầu.

Dựa vào trình tự adapter người ta thiết kế mồi PCR, mồi gồm hai phần: một phần có trình tự nucleotide bổ sung với adapter và phần còn lại là những nucleotide đựơc thêm vào tuỳ ý, thông thường từ 1 đến 3 nucleotide. Với mồi thiết kế như vậy thì chỉ có những đoạn ADN có trình tự ở hai đầu bổ sung với trình tự mồi mới được nhân bản.

*Đặc điểm:

Do kết hợp được những đặc điểm của kỹ thuật RFLP và kỹ thuật RAPD nên kỹ thuật AFLP có nhiều ưu điểm: đơn giản, ổn định, khả năng ứng dụng rộng và do có thể bổ sung các nucleotide khác nhau khi thiết kết mồi nên số lượng mồi có thể thiết kế được và tiềm năng ứng dụng rất lớn. Về cơ bản AFLP là chỉ thị trội và vị trí nhiễm sắc thể của chúng chưa xác định, do vậy nếu dùng chỉ thị này để lập bản đồ gen ở quần thể F2 thì cần phải sử dụng kết hợp với các chỉ thị khác đã biết trước vị trí nhiễm sắc thể như: RFLP hoặc microsattelite.

*kỹ thuật RFLP

RFLP là một phương pháp nhận dạng ADN bằng cách lai axít nucleic. Bản chất của phương pháp này là dựa trên sự phân cắt ADN bằng enzym giới hạn và sự lai (liên kết) giữa các bazơ bổ sung trên hai sợi đơn axít nucleic (sợi ADN hoặc mARN). Khi xử lý ADN bằng ezim giới hạn sẽ thu được những mảnh ADN nhỏ hơn có kích thước khác nhau, những mảnh này sau đó được điện di và cho lai với mẫu dò, nếu chúng bổ sung với mẫu dò thì sẽ cho phản ứng lai. Kết quả của phản ứng lai là chúng ta có thể xác định được sự đa hình giữa các mẫu ADN khác nhau. RFLP được viết tắt từ cụm từ tiếng Anh Restriction Fragment Length Polymorphism có nghĩa là đa hình độ dài mảnh giới hạn. Lai axít nucleic bao gồm hai kiểu, lai ADN (DNA hybridization) hay còn gọi là lai Southern và lai ARN (ARN hybridization) hay còn gọi là lai Northern. Về nguyên tắc lai Northern cũng tương tự như lai Southern, chỉ khác là lai Northern được thực hiện giữa mẫu dò với ARN thông tin và trong phép lai này không có bước xử lý enzym giới hạn. Kỹ thuật lai axít nucleic đã được ứng dụng rộng rãi và có ý nghĩa rất quan trọng trong lập bản đồ gen, phân lập gen, xác định số bản sao của một gen, phân tích cấu trúc và chức năng gen, xác định nồng độ và kích thước mARN...

12. Trình bày một số thành tựu nổi bật của công nghệ gen thực vật đã được ứng dụng trong nông nghiệp. ( tự học trong slide)

13. trình bày tách chiết DNA tổng số ( trình bày các hóa chất)

Một số hoá chất thông dụng dùng trong tách chiết axít nucleic

*Ni tơ lỏng:

Nitơ tinh khiết là một chất khí ở dạng phân tử không màu và không tham gia phản ứng hóa học ở nhiệt độ phòng. Nitơ hóa lỏng ở nhiệt độ -196°C. Nitơ lỏng là chất làm lạnh phổ biến.

Nitơ lỏng được sản xuất theo quy mô công nghiệp với một lượng lớn bằng cách chưng cất phân đoạn không khí lỏng và nó thường được nói đến theo công thức giả LN2. Nó là một tác nhân làm lạnh (cực lạnh), có thể làm cứng ngay lập tức các mô sống khi tiếp xúc với nó. Thông thường để phá màng/vỏ tế bào chúng ta phải dùng nitơ lỏng, vì nitơ lỏng có 2 tác dụng chính đó là:

+ Làm cho màng bị cứng giòn, dễ bị vỡ khi nghiền

+ Và ni tơ lỏng giữ cho mẫu ở trạng thái lạnh, trạng thái mà các enzym phá huỷ axít nucleic không hoạt động cho tới khi chúng bị ức chế bằng hoá chất.

Một số qui trình sử dụng vật liệu đông khô, bởi vật liệu đông khô dễ phá vỡ màng hơn, mặt khác sử dụng vật liệu đông khô không cần giữ mẫu ở trạng thái lạnh, vì trong môi trường khô tuyệt đối các ezim phá huỷ axít nucleic cũng vô tác dụng.

*EDTA:

Ethylenediaminetetraacetic acid [CH2N(CH2CO2H)2]2 Trong phòng thí nghiệm, EDTA được sử dụng rộng rãi để giữ các ion kim loại làm dừng hoạt động của các enzym để ngăn chặn thiệt hại cho DNA hoặc protein. EDTA được thêm vào một số dung dịch đệm.

Khi màng bị phá vỡ, một loạt các chất đựơc giải phóng ra dung dịch, trong số chúng có các loại emzim thuỷ phân axít nucleic thành những mảnh vụn, bởi vậy ức chế sự hoạt động của enzym này bằng EDTA. Các ion hoá trị hai như: Mg2+ và Ca2+.v.v. rất cần thiết cho sự hoạt động của enzym thuỷ phân axít nucleic. Nếu trong dung dịch có EDTA, chất này sẽ liên kết với các ion hoá trị hai nói trên, liên kết này dẫn tới sự ức chế hoạt động của enzym thuỷ phân axít nucleic, do vậy mà axít nucleic sẽ không bị phân huỷ.

Tris: tris(hydroxymethyl)aminomethane. C4H11NO3. Axít nucleic còn bị ảnh hưởng rất lớn bởi độ axít và kiềm của dung dịch sử dụng trong tách chiết, axít có thể làm cho axít nucleic bị gãy, chẳng hạn axít clohydric (HCl) làm cho ADN bị đứt ở những vị trí purin, trong khi đó nếu ở nồng độ kiềm cao thì ADN sẽ bị tách thành sợi đơn. Để loại trừ ảnh hưởng của axít và kiềm người ta đã sử dụng Tris để điều chỉnh pH của dung dịch.

*CTAB (Cetryl Ammonium Bromide):

(C16H33)N(CH3)3Br), Là hoá chất dùng trong chiết suất axít nucleic có hiệu quả cao và đang được sử dụng phổ biến hiện nay. CTAB dung dịch là một dung môi có khả năng hoà tan cao axít nucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết axít nucleic. Để tăng hiệu quả hoạt động của CTAB, mẫu đựơc xử lý với nhiệt khoảng từ 55OC đến 65OC. Ở nhiệt độ như vậy, nó còn có tác dụng làm rách thêm màng tế bào và màng nhân để giải phóng tối đa lượng axít nucleic ra dung dịch và làm biến tính một số protein, đặc biệt là enzym thuỷ phân axít nucleic.

*Chloroform: CHCl3

Trong dung dịch tách chiết, ADN tạo thành liên kết với CTAB, để loại bỏ CTAB và đồng thời làm biến tính protein trong dung dịch cần sử dụng chloroform. Sau đó dung dịch tách chiết được ly tâm, loại bỏ các tạp chất (bị kéo xuống phần phía dưới ống nghiệm) còn lại axít nucleic hoà tan trong lớp dung dịch nằm phía trên và được chuyển sang một ống nghiệm mới.

*Ethanol hoặc isopropanol: (CH3)2CH-OH

Ethanol thường được dùng trong môi trường dung dịch có lực ion, hay nồng độ muối cao, trong điều kiện như vậy axít nucleic dễ dàng bị kết tủa, sự kết tủa của axít nucleic sẽ đạt hiệu quả cao hơn nếu như được xử lý trong môi trường lạnh.

Isopropanol được dùng để kết tủa axít nucleic trong môi trường không cần có muối, tỷ lệ lượng isopropanol/mẫu theo thể tich là: 1/1. Sử dụng isopropanol có ưu việt là các axít nucleic có trọng lượng phân tử thấp như: những mảnh gãy ADN hoặc ARN.v.v. sẽ không bị kết tủa và chúng dễ dàng bị loại bỏ cùng dung dịch.

*Enzym RNnase và enzym Dnase:

Khi kết tủa sẽ thu được axít nucleic gồm: ADN và ARN:

Nếu mục tiêu là thu ADN, chúng cần phải loại bỏ ARN. Để loại bỏ ARN, ta dùng enzym RNase. Enzym RNase sẽ cắt ARN thành những mảnh vụn, do vậy sau khi ly tâm ADN lắng tủa và được giữ ở đáy ống nghiệm, còn những mảnh vụn ARN vẫn nằm trong dung dịch, bởi vậy khi loại bỏ dung dịch thì ARN cũng bị loại bỏ theo.

Ngược lại nếu cần loại bỏ ADN, chúng ta dùng enzym DNase, cũng tương tự như việc loại bỏ ARN, ADN sẽ bị cắt vụn bởi DNase và chúng cũng bị loại bỏ cùng dung dịch

*Nước cất và TE:

Axít nucleic có thể đựơc hoà tan trong nước cất khử trùng hoặc dung dịch TE. Axít nucleic sẽ được bảo quản tốt hơn, nếu nó được hoà tan trong dung dịch TE, vì dung dịch này chứa Tris và EDTA.

Bạn đang đọc truyện trên: AzTruyen.Top

Trước Sau

Tags: #lamking88