Câu 6: Viết phương trình động học Michaelis-Menten, hãy phân tích ý nghĩa của các thông số trong phương trình này. Hệ số Km có ý nghĩa gì, làm thế nào để xác định được hệ số Km?

Phương trình động học Michealis - Menten

Trong đó:

Vo : tốc độ phản ứng ban đầu

Vmax: tốc độ phản ứng tối đa

Km : hằng số Michaelis

[S] : nồng độ cơ chất.

Học thuyết Michaelis - Menten dựa trên cơ sở giả thiết rằng, phức enzyme - cơ chất được tạo thành trong quá trình phản ứng hóa học, sau đó được phân giải thành enzyme tự do và sản phẩm:

Enzyme + Cơ chất Phức Enzyme - cơ chất Enzyme + sản phẩm

Hay

E + S ES E + P

Gọi: [Eo]¬ là nồng độ enzyme ban đầu

[ES] là nồng độ phức trung gian enzyme - cơ chất

[E] là nồng độ enzyme tự do khi phản ứng cân bằng

[S] là nồng độ cơ chất khi phản ứng cân bằng

k1, k -1, k2 là hằng số tốc độ phản ứng tương ứng.

Michaelis - menten giả định rằng cân bằng giữa Enzyme, cơ chất và phức enzyme - cơ chất được thiết lập ngay lập tức và duy trì trong quá trình phản ứng, còn phản ứng phân giải ES thành sản phẩm là quá chậm (k -1¬>> k2) không ảnh hưởng đến cân bằng, do đó cân bằng của giai đoạn đầu tiên (ks) cũng là hằng số phân ly ES.

[ES] = [Eo¬] - [E]

[ES] = (*)

Vận tốc chuyển hóa ES thành sản phẩm phản ứng chi phối vận tốc chung của toàn bộ phản ứng: vo = k2[ES]

Vận tốc phản ứng đạt cực đại (V) khi toàn bộ E ban đầu kết hợp với S tạo thành phức ES, do đó V = k2[Eo]

Như vậy:

Thay [ES] từ phương trình (*) vào ta có:

Vo = (1)

Phương trình này chưa thể khái quát hết được các phản ứng enzyme vì giả định mà Michaelis - Menten đề ra không sử dụng được cho các phản ứng enzyme xảy ra với vận tốc đủ nhanh.

Vì thế G.E. Briggs và John B. S. Haldane đã đề ra giả định trạng thái dừng có tính chất khái quát hơn. Theo giả định này, ở thời điểm đạt được trạng thái dừng (nồng độ ES không đổi), vận tốc phản ứng tạo thành phức ES bằng vận tốc phân giải nó, bao gồm cả phản ứng phân giải ES tạo thành E và S, và phản ứng phân giải ES tạo thành E và P.

Phương trình biểu diễn trạng thái dừng:

k1[E][S] = k -1[ES] + k2[ES] = [ES].(k -1 + k2)

ký hiệu Km = như vậy Km = Ks +

Tương tự như trên, thay Ks = Km ta có vo = (2)

Đây là phương trình Michaelis - Menten hoàn thiện, có thể thấy phương trình (1) và (2) hoàn toàn giống nhau chỉ khác về định nghĩa hằng số K. Trong đó Km gọi là hằng số Michaelis - Menten, giả định cân bằng của Michaelis - Menten được xem như là một trường hợp riêng khi k -1 >> k2 của giả định trạng thái dừng.

 Phương trình biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng với nồng độ cơ chất. Có thể biểu diễn bằng dạng hiperbol:

Có thể giải thích của đường biểu diễn dạng hiperbol như sau:

Trong phản ứng có enzyme xúc tác số phân tử cơ chất lớn hơn số phân tử enzyme rất nhiều (S>E). Cơ chất chỉ được chuyển hoá khi tạo thành phức hệ enzyme. Do đó tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ phức hệ [ES].

Nồng độ [ES] ở 3 điểm A, B, C không giống nhau. Ở điểm A và B còn vài phân tử enzyme chưa kết hợp với cơ chất, do đó nếu tăng hay giảm nồng độ cơ chất [S] sẽ làm tăng hay giảm sự va chạm giữa E và S nghĩa là làm tăng hay giảm nồng độ [ES] và sẽ ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng và tốc độ là hàm số của nồng độ cơ chất [S].

Tới điểm C tất cả phân tử enzyme đã kết hợp với S nên khi tăng nồng độ cơ chất có thể làm tăng dần sự va chạm giữa E và S nhưng không làm tăng tốc độ phản ứng.

Vì không còn enzyme tự do để có thể gắn thêm vào cơ chất và tốc độ đạt được đã là cực đại.

Ở điểm B đúng 1/2 số phân tử enzyme đã kết hợp với cơ chất, tốc độ ở đó = 1/2 Vmax và nồng độ cơ chất tương ứng với điểm B bằng hằng số Km.

 Hệ số Km.

Trị số đặc trưng của mỗi phản ứng enzyme là hằng số Michaelis Km - là trị số nồng độ cơ chất mà tại đó tốc độ của phản ứng bằng 1/2 Vmax.

Km đặc trưng cho ái lực giữa E và S. Km càng nhỏ ái lực E - S càng lớn => tốc độ phản ứng càng lớn. Và ngược lại.

Xác định Km.

Hằng số Km có thể tìm thấy dựa trên cơ sở:

Nồng độ của Enzyme tự do sau khi phức hợp được tạo thành là: [E] = [Eo¬] - [ES]

Tốc độ của các phản ứng chung tùy thuộc vào các tốc độ hình thành và phân giải của phức ES. Sự tái lập phức từ E và sản phẩm thường được bỏ qua. Ở trạng thái bền, tốc độ của sự hình thành ES là v1, tốc độ phân giải nó là v2 là giống nhau nên:

k1[S]([Eo] - [ES]) = [ES].(k -1 + k2)

Tốc độ của sự hình thành sản phẩm: v = k2[ES]

Giá trị của [ES] được rút ra từ những phương trình:

= = Km

[ES] =

Tốc độ cực đại Vmax đạt được tại những giá trị nồng độ cơ chất cao khi tất cả các phân tử enzyme được bão hòa. Khi đó [ES] = [Eo]

Do đó ta có: Vmax = k2 [ES] = k2[Eo]

Hằng số Km được tính:

Nếu v = Vmax/2 thì Km = [S] và tốc độ phản ứng là:

Câu 7. Các phương pháp tinh sạch protein enzyme, cho biết ưu điểm của các phương pháp đã nêu. Làm thế nào để đánh giá được mức độ của protein, enzyme?

 Các phương pháp tinh sạch protein enzyme.

• Ly tâm

Một trong những kỹ thuật không thể thiếu được trong việc tách chiết và tinh chế protein là ly tâm. Máy ly tâm được sử dụng để tách các phần khác nhau khỏi dung dịch, sự ly tâm tăng tốc độ kết tủa của những tiểu phần rắn nhờ lực ly tâm. Sự sai khác về tỷ trọng của nguyên liệu lơ lững so với chất lỏng càng lớn thì tốc độ kết tủa sẽ càng cao. Máy li tâm hoạt động theo nguyên tắc cân bằng đối xứng khi ly tâm và thăng bằng máy ly tâm khi hoạt động.

Do tính chất không bền với nhiệt của phần lớn các protein enzyme, khi tách chiết tinh chế chúng, cần sử dụng máy ly tâm lạnh hoặc duy trì mẫu ở nhiệt độ thấp trước khi li tâm..

• Thẩm tích

Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất keo hòa tan (protein, một số các polysaccharid) nhưng thấm đối với các dạng dịch các tinh thể. Các protein enzym có thể khuếch tán qua màng theo định luật Fick..

Nước sẽ khuếch tán từ dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường là dung dịch rửa) vào dung dịch keo, trong khi đó các protein sẽ chuyển vào dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường chuyển vào dung dịch rửa).

Tiến hành: cho dung dịch protein vào túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm (túi colodion hoặc Cellophane) sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượng lớn nước hoặc lượng lớn dung dịch đệm được pha loãng (đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M). Khi đó muối sẽ khuyến tán vào nước hoặc dung dịch đêm loãng, còn nước hoặc đệm loãng sẽ di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein. Protein là những đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giử lại trong túi. Bằng cách thay đổi thường xuyên dung dịch rửa có thể tẩy sạch muối ammonium sulphate ra khỏi protein.

Khi thẩm tích các protein thường người ta tiến hành tất cả các thao tác ở môi trường lạnh.

• Sắc ký lọc gel (gel filtration)

Sắc ký lọc gel là một trong những kỹ thuật sắc ký cột được dùng phổ biến trong tách chiết và tinh sạch protein.

Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau nhau về kích thước, hình dạng và phân tử lượng của protein enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra.

Để đảm bảo cho việc tách protein enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein enzyme, không hòa tan và tương đối bền với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học. Chất được sử dụng để lọc phân tử phải là chất không có tính đàn hồi (không co) và phải là chất ưa nước.

Gel sephadex là chất thỏa mãn các yếu tố trên. Sephadex là chế phẩm dextran do các loài vi sinh vật khác nhau là Leuconostoc tạo ra khi chúng được nuôi cấy trên môi trường chứa saccharose.

Phương pháp lọc phân tử trên Sephadex được tiến hành như sau: cho sephadex vào cột thủy tinh dài và cân bằng bằng dung dịch đệm có pH nhất định. Sau đó cho dung dịch protein enzyme lên cột. Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợp, các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ (ở đây là các muối) sẽ khuếch tán chậm chạp qua các lỗ nhỏ của các hạt Sephadex bị trương phồng, còn chất có trọng lượng phân tử lớn hơn (ở trường hợp này là protein enzyme) không có khả năng đi vào mà lách nhanh qua các hạt sephadex và sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột .Vì vậy ta có thể tách được chất có trọng lượng phân tử cao hơn thoát ra khỏi cột gel trước so với chất có phân tử lượng nhỏ.

Phương pháp lọc rây phân tử trong quá trình tinh chế protein enzyme, chúng còn được sử dụng để cô đặc dung dịch protein enzyme

• Phương pháp sắc ký trao đổi ion.

Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các protein enzyme. Hay nói cách khác, phương pháp này được dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion. Tác nhân (hay nguyên liệu) trao đổi ion có thể là chất nhựa có tích nhóm sinh ion hoặc là chất ionit. Đây là những chất giá trơ, không tan trong nước, có bản chất là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect) hoặc là chất nhựa polistirol. Chất giá thể này thường kết hợp với các nhóm ion hóa. Các chất trao đổi ion có chất giá là celluose, sephadex, molselect thông thường được dùng để tách protein enzyme, còn các chất trao đổi ion có chất giá là polistirol (ví dụ như Dowex, Amberlite) chỉ dùng để tách các peptid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn.

- Các chất trao đổi ion có chất giá cellulose

• Cationit CM - cellulose (carboxylmetyl - cellulose)- là một dẫn xuất este của cellulose.

• Anionit DEAE - cellulose (diethylamino - ethyl - cellulose) là dẫn xuất este của cellulose)

- Nếu chất giá là sephadex thì chúng ta có chất trao đổi ion sephadex.

• Gồm DEAE - sephadex và CM - sephadex.

Ưu điểm : vừa tách được protein enzyme về kích thước và về điện tích

tổng số của các protein enzyme.

• Phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học hay là phương pháp sắc ký ái lực (affinity Chromatography).

Sắc kí ái lực là một phương pháp dùng để tách hốn hợp các chất dựa vào tương tác đặc hiệu cao (ái lực:

Các tương tác giữa kháng nguyên, kháng thể

Enzym, cơ chất

Thụ thể và chất gắn thụ thể

Cơ sở của phương pháp này là người ta gắn những phân tử gắn (ligand) vào chất mang rắn (chất giá) bằng liên kết cộng hóa trị mà protein enzyme cần tách sẽ tương tác đặc hiệu với nó. Những chất đó có thể là cơ chất (Substrate) hoặc chất ức chế (inhibitor) cạnh tranh.

Ở trên cột giá thể hay chất mang chứa cơ chất cố định ở pH và lực ion phù hợp, chỉ có protein enzyme nào có khả năng chuyển hóa cơ chất mới gắn vào, các protein khác thì chảy xuống cột. Bằng cách thay đổi pH và lực ion phù hợp hoặc có thể bằng cách thêm chất ức chế cạnh tranh đã được hòa tan vào thì có thể tách được protein enzyme khỏi cột ở trạng thái sạch.

 Phương pháp đánh giá mức độ protein enzym

- Điện di một chiều

Điện di luôn được thực hiện trên gel (hay trên vật thể rắn như giấy) bởi gel giống như một cái ray phân tử sẽ làm tăng sự phân tách. Những phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ gel sẽ có thể di chuyển xuyên qua gel, trong khi đó những phân tử lớn hơn lỗ gel thì gần như không di chuyển. Những phân tử có kích thước trung bình di chuyển trong gel với nhiều vận tốc khác nhau. điện di được thực hiện trên một bảng polyacrylamide mỏng, thẳng đứng. Hướng của dòng điện từ trên xuống.

Gel polyacrylamide là gel được sử dụng rộng rãi. Các protein có thể được phân tách dựa trên khối lượng bằng điện di trên acrylamide dưới điều kiện đã bị biến tính. Những protein nhỏ di chuyển nhanh trong gel, trong khi những protein lớn ở phía đầu, gần vị trí nạp mẫu.

SDS-PAGE có độ phân tách cao, cho kết quả nhanh và độ nhạy cao. Vì vậy, SDS-PAGE giúp chúng ta đánh giá kết quả của quá trình tinh sạch. Với những phân đoạn đầu tiên, kết quả là dãy gồm rất nhiều protein. Nhưng qua mỗi bước tinh sạch, số lượng protein sẽ giảm và sẽ có một băng ngày càng đậm. Vạch đó tương ứng với protein mục tiêu.

V.2 Điện di dựa vào điểm đẳng điện

Các protein còn có thể được phân tách bằng điện dựa vào tỉ lệ giữa số acid amin có tính acid và số acid amin có tính base của chúng. Ta có phương pháp phân tách protein dựa vào điểm đẳng điện của protein. để tạo Khuynh độ pH, trước hết cho vào gel một hỗn hợp polyampholyte có nhiều giá trị pI, sau đó điện di hỗn hợp này. Điện di dựa vào điểm đẳng điện phân tách protein nhanh với khả năng phân biệt được sự chênh lệch pI khoảng 0.01 hay những protein khác nhau chỉ một đơn vị điện tích cũng có thể được phân tách bằng phương pháp này.

V.3 Điện di hai chiều

Đây là một phương pháp có khả năng phân tách cao do sư kết hợp SDS-PAGE với điện di dựa vào điểm đẳng điện. Mẫu protein đầu tiên sẽ được chạy điện di dựa vào điểm đẳng điện. sau đó, đặt khoảng gel có chứa protein vừa được điện di lên tấm gel SDS-polyacrylamide theo phương nằm ngang. Protein sẽ chịu một điện trường theo chiều dọc. Kết quả là một mô hình các điểm được phân tách hai chiều, chiều ngang theo điểm đẳng điện, chiều dọc theo khối lượng.