Câu 16: Khái niệm và các bước cơ bản của phương pháp western blot và ứng dụng:

1. Khái niệm:

Là kỹ thuật lai giữa protein với protein ( giữa kháng nguyên với kháng thể ), protein kháng nguyên được phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang.

2. Các bước cơ bản của phương pháp Western Blot:

_ Tách protein tổng số, xử lý protein thành cấu trúc bậc 1,

_ Điện di protein trên gel SDS polyacrylamide,

_ Chuyển protein gel sang màng lai bằng phương pháp thẩm thấu,

_ Xử lý màng lai, lấp đầy khoảng trống trong màng lai nhằm ngăn cản protein lạ bám vào màng lai,

_ Lai : màng lai được lai với kháng thể 1 ( mẫu dò 1 ), mẫu dò dùng lai là kháng thể của protein cần phát hiện ( kháng nguyên ),

_ Rửa màng lai để loại bỏ kháng thể 1 không lai và lai tiếp với kháng thể 2 có gắn E phân hủy cơ chất tạo màu, hoặc gắn 1 chất phát huỳnh quang. Kháng thể 2 là kháng thể đối kháng với kháng thể 1,

_ Phát hiện vị trí lai : rửa loại bỏ kháng thể 2 và hiện màu.

* Ứng dụng :

_ Xác định sự hoạt động của gen thông qua sự có mặt của protein trong mô,

_ Đánh giá mức độ hoạt động mạnh yếu của gen mục tiêu,

_ Xác định độ lớn của gen mục tiêu.