Câu 10 : Mục đích của việc tạo dòng gen. Các bước cơ bản của phương pháp tạo dòng gen.

1. Mục đích của việc tạo dòng gen :

Kỹ thuật tách dòng gen bao gồm việc phải cài một mảnh DNA lạ vào một vector bằng phương pháp hóa sinh. Sau đó đưa phân tử lai này vào tế bào chủ bằng phương pháp biến nạp hoặc tải nạp.

Mục đích của sự tạo dòng gen :

_ Thiết lập ngân hàng bộ gen

_ Thiết lập ngân hàng cDNA

_ Sản xuất protein, Enzym

_ Sản xuất vacxin, sản xuất kháng sinh.

2. Các bước cơ bản của phương pháp tạo dòng gen :

1_ Tách lập các DNA lạ cần tạo dòng :

+ Chọn và cắt DNA lạ của tế bào cho bằng một E cắt hạn chế.

+ Phân lập đoạn DNA phù hợp với vector và mục đích cần tạo dòng

+ Tạo đầu dính khi cần thiết.

2_ Chọn và xử lý vector :

+ Chọn vector cần chú ý những yêu cầu về độ lớn của gen lạ, loại tế bào chủ tiếp nhận vector, và phương pháp ứng dụng.

+ Xử lý vector : cắt vector bằng E cắt hạn chế cùng loại với E đã cắt DNA trên, khử nhóm phosphat bằng E alkaline phosphatase để tránh hai đầu vector đóng trở lại.

3_ Tạo DNA tái tổ hợp :

+ Bằng cách ghép DNA lạ vào vector đã được cắt cùng một loại E cắt hạn chế, khi đó chúng sẽ ghép đôi những đầu dính lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung.

+ Mỗi phản ứng nối có sự có mặt của E DNA ligase để hoàn chỉnh phân tử lai.

4_ Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ nhờ phương pháp biến nạp hoặc tải nạp :

+ Nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao.

+ Việc chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn tức là làm cho tế bào vi khuẩn trở thành khả biến, nghĩa là có khả năng thấm vector tái tổ hợp.

+ Biến nạp : là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho sang tế bào thể nhận không cần sự tiếp xúc giữa hai tế bào hoặc nhân tố trung gian.

+ Tải nạp : là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho sang tế bào thể nhận qua nhân tố trung gian là virus.

5_ Phát hiện dòng cần tìm : túy vào mục đích nghiên cứu mà người ta có biện pháp phát hiện dòng cần tìm :

+ Nếu mục đích là nghiên cứu nghiên cứu đoạn gen chưa biết người ta thường dùng đầu dò. Nếu đoạn DNA đã biết ( cDNA ) công việc sẽ đơn giản và nhanh chóng.

6_ Kiểm tra và thu nhận sản phẩm của gen tái tổ hợp :

+ Nếu mục đích thiết lập ngân hàng cDNA : đầu tiên phải tách plasmid tái tổ hợp ra khỏi dịch nuôi cấy, cắt plasmid tái tổ hợp bằng RE loại 2 và thu được hai băng DNA, một có độ dài bằng khung vector và một có độ dài tương ứng đúng bằng cDNA. Kiểm tra lại cDNA đã được cắt  bằng điện di trên gel agarose và kiểm tra lại độ dài của cDNA.

+ Nếu sản phẩm của gen tái tổ hợp là protein, hormone, kháng sinh...người ta có thể thu nhận sản phẩm bằng phương pháp tách, chiết, lắng, lọc, ly tâm kết tủa phân đoạn hoặc trao đổi ion.