1

CÔNG NGHỆ ENZYME

(Enzyme technology

Technologie des enzymes

Enzymtechnologie)

Người trình bày:

Bùi Văn Ngọc

Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm

KH&CN Việt Nam

Email: [email protected] hoặc [email protected]

Hà Nội, tháng 8 năm 2016

2

Chương 3: Sản xuất enzyme thực vật và động vật

3.1 Sản xuất enzyme thực vật

3.1.1 Sản xuất enzyme từ hạt nảy mầm

3.1.2 Thu nhận urease từ đậu tương (nành)

3.1.3 Thu nhận bromelain từ dứa

3.1.4 Thu nhận papain từ đu đủ

3.2 Sản xuất enzyme động vật

3.2.1 Thu nhận pancreatin

3.2.2 Thu nhận pepsin

3.2.3 Thu nhận rennin

3

Sự khác nhau giữa tế bào vi sinh vật, thực vật và động vật

4

Sự khác nhau giữa tế bào động vật và thực vật

5

So sánh các thành phần cấu tạo giữa các tế bào động vật, thực

vật và vi sinh vật

6

Sản xuất enzyme thực vật (Quy trình tổng quát)

Nguyên

liệu

Phá vỡ tế bào

Thu dịch enzyme

(xem lại mục

1.7 chương 1)

Tách enzyme

Tinh sạch enzyme

Chế

phẩm

7

3.1 Sản xuất enzyme thực vật

•  Các α, β-amylase (EC 3.2.1.1) có trong malt đại mạch và

malt thóc

•  Urease (EC 3.5.1.5) có trong giá đậu tương,

•  Bromelain (Bromelin) có trong thân, lá, chồi, vỏ, cuống

quả dứa (EC 3.4.22.32) hoặc thịt quả dứa (EC 3.4.22.33)

•  Papain (EC 3.4.22.2) từ nhựa đu đủ

•  Lipase có trong mầm hạt thầu dầu

•  Các enzyme plazmin, papain, ficin có trong thực vật họ Ficus

(sung, si, vả)

•  Polyphenoloxydase có trong lá chè. Ngoài ra, trong lá chè

còn chứa protease, pectinase, amylase, invertase (góp phần

tạo màu sắc và hương thơm cho chè)

•  http://enzyme.expasy.org

8

http://enzyme.expasy.org (tìm và tra cứu enzyme)

9

Sản xuất các α, β-amylase (EC 3.2.1.1) từ malt

•  Malt đại mạch: Các enzyme thủy phân tinh bột trong đại

mạch chủ yếu là α, β-amylase. Quá trình nảy mầm của đại

mạch là giai đoạn chuyển hóa enzyme từ trạng thái không

hoạt động sang trạng thái hoạt động, đồng thời sinh tổng

hợp thêm các enzyme mới.

•  Malt thóc: Hệ enzyme trong thóc cũng tương tự như trong

đại mạch, chỉ khác về mức độ tạo thành hệ enzyme và tốc

độ phản ứng.

10

Sản xuất các α, β-amylase từ malt đại mạch

Thành phần cấu tạo của đại mạch

và sự hình thành các enzyme trong

qúa trình này mầm

11

Yêu cầu về nguyên liệu (đại mạch)

•  Hạt có màu vàng óng ánh, thơm mùi rạ tươi

•  Hạt phải thuần, tỷ lệ hạt ngoại lai chỉ được chiếm 5%, Không

có hạt bị bệnh

•  Vỏ hạt chiếm < 7 – 9% trọng lượng hạt. Trọng lượng 1000

hạt khoảng 40 – 44 g

•  Sức nảy mầm (qua ngày thứ 3 của quá trình nảy mầm ): 80

– 90%

•  Khả năng nảy mầm (tính đến ngày thứ 5 của quá trình nảy

mầm): > 95%

•  Độ ẩm của hạt khoảng 15%

•  Trọng lượng riêng: 650 – 680 g/L

•  Hàm lượng protein: 9 – 12%

•  Hàm lượng tinh bột > 63 – 65%

12

Quy trình sản xuất malt đại mạch

Đại

Làm sạch

mạch

Sấy bảo quản

Ngâm hạt

Ủ mầm

Sấy malt

Tách mầm rễ

Malt

khô

13

Một số bước cơ bản và những lưu ý trong qúa trình

ngâm hạt đại mạch

•  Ngâm hạt: Đại mạch được ngâm trong nước sạch cho đến khi đạt

đến sự cân bàng về độ ẩm. Đảo trộn khối hạt thường xuyên để

thông khí trong khối hạt. Mục đích của giai đoạn này là tạo độ ẩm

cho hạt có điều kiện lấy đủ oxy, đẩy CO2 và các sản phẩm bất lợi

cho quá trình nảy mầm của hạt ra ngoài khối hạt

•  Trong qúa trình ngâm hạt, nước sẽ ngấm vào hạt làm cho thể tích

hạt tăng lên, các enzyme đang ở trạng thái không hoạt động

chuyển sang trạng thái hoạt động. Hoạt tính của enzyme sẽ tăng

dần và thuỷ phân các chất dự trữ có phân tử lượng cao ở trong hạt

thành các chất có phân tử lượng thấp hơn như đường, amino acid.

Vì vậy, cần phải luôn luôn chú ý đến sự thông khí, độ ẩm của hạt

và nhiệt độ

•  Sấy malt: Ngừng qúa trình nảy nầm bằng cách sấy hạt ở nhiệt độ

thích hợp

14

Sản xuất các α, β-amylase từ malt thóc

Thành phần cấu tạo của hạt thóc

15

Quy trình sản xuất malt thóc

Làm sạch,

Hạt

phân loại

thóc

Sấy bảo

quản

Ngâm hạt

Ủ mầm

Sấy malt

Tách mầm

Malt

rễ

khô

16

Một số bước cơ bản và những biến đổi sinh lý, sinh hoá

trong qúa trình sản xuất malt thóc

•  Ngâm hạt: Trong hạt thóc có sẵn một lượng nước ở dạng liên kết. Khi

ngâm hạt, nước từ bên ngoài thấm vào hạt sẽ hoà tan các chất dự trữ,

hoạt hóa các enzyme xúc tác quá trình phân giải các hợp chất cao phân

tử thành những chất đơn giản cung cấp cho hoạt động tăng trưởng của

phôi để hình thành cây mầm. Phôi là nơi hút nước mạnh nhất. Tốc độ hút

nước rất mạnh ở thời gian đầu do có sự chênh lệch áp suất thẩm thấu rất lớn giữa môi trường bên ngoài và các tế bào bên trong hạt, đồng thời các chất keo háo nước trương nở rất mạnh, càng về sau, sức hút nước của

hạt càng giảm

•  Trong qúa trình nảy mầm của hạt, khi có đầy đủ các điều kiện thích hợp về độ ẩm, nhiệt độ, các enzyme như amylase, protease,... hoạt động

mạnh xúc tác phản ứng thuỷ phân các chất cao phân tử như tinh bột và

cel ulose, protein thành những chất đơn giản hơn.

•  Ủ mầm: qúa trình này trải qua 3 giai đoạn

-  Giai đoạn 1: kéo dài 3 ngày, ngày thứ ba bắt đầu nảy mầm. Nhiệt độ của khối hạt tăng nhanh do hoạt động hô hấp mạnh. Khối hạt cần được đảo 2 - 3 lần/ngày .

-  Giai đoạn 2: kéo dài 3 ngày. Giai đoạn này chồi mầm và rễ mầm tăng trưởng nhanh, nhiệt độ khối hạt cũng tăng nhanh do hoạt động hô hấp cao. Khối hạt cần được đảo 2 - 3lần/ngày

-  Giai đoạn 3: những ngày sau quá trình nảy mầm xảy ra chậm dầm, nhiệt độ tăng yếu và khối hạt cũng cần được đảo 2 - 3 lần/ngày

17

Sự hoạt động của các enzyme trong qúa trình nảy mầm

của hạt

•  α-amylase: Enzyme này không hoàn toàn hoạt động ở hạt chín.

Hoạt động của α-amylase tăng dần trong quá trình nảy mầm của

hạt. Ở nhiệt độ 15 – 17 ºC hoạt động của α-amylase đạt đến cực đại

vào ngày thứ 10 – 12. Ở nhiệt độ 28 – 30 ºC, hoạt động của α-

amylase đạt cực đại vào ngày 5 – 8 (?).

•  β-amylase: Enzyme β-amylase tồn tại ở dạng liên kết và một số ít

hoạt động rất yếu trong hạt chín hoàn toàn. Hoạt động này tăng nên

trong quá trình hạt nảy mầm. Thời gian để hoạt động của enzyme

này đạt đến cực đại cũng tuỳ thuộc vào nhiệt độ .

•  Enzyme oxy hoá khử: Hoạt động của các ezyme này tăng nên mạnh

do đó hoạt động hô hấp của hạt cũng tăng theo. Hoạt động hô hấp

của hạt mạnh nhất vào ngày thứ 4–6 ở nhiệt độ 27 – 28 ºC và

cường độ hô hấp phụ thuộc vào độ ẩm của hạt, nhiệt độ vào lượng

O2 cung cấp.

18

Tách và tinh chế amylase

•  Các phương pháp phá vỡ tế bào (xem lại mục 1.7 chương 1)

•  Các phương pháp tinh chế enzyme

-  Tinh sạch amylase bằng các phương pháp sắc ký

-  Tinh sạch amylase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide

(SDS-PAGE)

19

Tách enzym, protein bằng các phương pháp sắc ký

Sắc ký lọc gel

20

Tách enzym, protein bằng các phương pháp sắc ký

Sắc ký trao đổi ion

21

Tách enzym, protein bằng các phương pháp sắc ký

Sắc ký ái lực

22

Tách enzym, protein bằng các phương pháp sắc ký

Sắc ký ái lực kim loại cố định

(IMAC)

23

Tách enzym, protein bằng các phương pháp sắc ký

Dung dịch rửa giải

chứa imidazole

Sắc ký ái lực kim loại cố định

(IMAC)

24

Phương pháp điện di sds-page (Sodium Dodecyl Sulfate

PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)

25

Tách enzym, protein bằng phương pháp điện di

26

Kết quả chạy điện di trên SDS-PAGE

27

3.1.2 Thu nhận urease (EC 3.5.1.5) từ đậu tương (nành)

28

Một số enzyme trong đậu nành

•  Urease:

Urease

•  Lipase:

•  Amylase (xem phần sau)

•  Lipoxygenase

•  Phospholipase

29

Cấu trúc và đặc tính của urease (EC 3.5.1.5)

•  Thuộc họ enzyme amidohydrolases, phosphotriesterases xúc tác phản ứng thuỷ phân urea thành carbon dioxide (CO2) và ammonia (NH3)

•  Urease có khuynh hướng làm tăng pH môi trường (?)

•  Trung tâm hoạt động có chứa nhóm SH, cần Nickel cho hoạt động xúc tác

•  Urease có cấu trúc bậc 4. Trọng lượng phân tử 480-545 kDa, 840 amino acid/ phân tử, trong đó 90 là các cystein

•  pH tối ưu: 7.4; pH đẳng điện (pI): 5 (?); Nhiệt độ tối ưu 60º C

•  Chất kìm hãm: các kìm loại nặng: chì (Pb), thuỷ ngân (Hg)

30

Cấu trúc và đặc tính của urease (EC 3.5.1.5)

•  Đặc hiệu cơ chất: Urea, hydroxyure, dihydroxyure

•  Chất hoạt hoá (activator): Những chất có tác dụng phục hồi

nhóm –SH thuộc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của urease là

những chất hoạt hoá, ví dụ glutathion dạng khử, L-cystein

31

Cấu hình không gian, đồng phân lập thể, danh pháp của các phần

tử sinh học

•  Amino acid

32

Cấu hình không gian, đồng phân lập thể, danh pháp của các phần

tử sinh học

•  Glucose

33

Cấu hình không gian, đồng phân lập thể, danh pháp của các phần

tử sinh học

•  Acid béo (fatty acid)

34

Cấu hình không gian, đồng phân lập thể, danh pháp của các phần

tử sinh học

•  Acid béo (fatty acid)

cis (DHA, omega 3 acid)

cis (Oleic acid)

trans (Linolelaidic acid)

trans (Vaccenic acid)

35

Đặc tính của urease (tiếp)

•  Chất kìm hãm (inhibitor):

-  Một số hợp chất hữu cơ ức chế urease

Urea (cơ chất)

Hydroxamic acid Hydroxamic acid Thiourea

Phenylurea

-  Các ion kim loại: Ag+, Hg+, Pb2+ làm biến tính protein (thay đổi cấu trúc bậc 4), ảnh hưởng đến TTHĐ

-  Acid mạnh, kiềm mạnh, tannin có khả năng làm mất hoạt tính của

enzyme (???)

36

Cơ chế tannin (pholyphenol) liên kết với nhóm

amine và carboxyl của amino acid

37

Quy trình thu nhận và tách chiết urease: Các bước

cơ bản

1.  Phá vỡ tế bào: Nghiền nát thành khối đồng nhất

2.  Ly trích enzyme bằng nước hoặc dung dịch muối loãng

(chứa nhiều enzyme và protein khác nhau). Có thể sử dụng

trực tiếp ở dạng lỏng (dung dịch chứa urease thô) hoặc cô

đặc thành dạng bột hoặc

3.  Tách và tinh chế enzyme ở dạng tinh khiết hơn (xem lại

mục 1.7 chương 1)

38

Một số phương pháp thu nhận chế phẩm urease

•  Thu nhận urease thô bằng phương pháp tủa bằng dung môi

hữu cơ: Tủa bằng acetone (1 dịch chiết /1 acetone, v/v), tủa

bằng cồn hay ethanol (1 dịch chiết/ 3 ethanol, v/v). Qúa trình

tủa nên tiến hành ở nhiệt độ thấp ( nhưng > nhiệt độ đóng

băng). Ly tâm, sấy chân không ở nhiệt độ thấp (<40º C) thu

được chế phẩm dạng bột

•  Thu nhận urease thô bằng phương pháp diêm tích (tủa bằng

muối): Tủa bằng muối (NH4)2SO4 (70%, 70 g muối/ 100 ml

dịch chiết). Các bước còn lại giống như phương pháp tủa

bằng dung môi hữu cơ.

Thường bổ sung chất độn (tinh bột, glucose) để ổn định hoạt

tính urease trong thời gian bảo quản

39

Ứng dụng của urease

•  Trong nông nghiệp: Do thực vật không sử dụng trực tiếp

nguồn nitrogen từ urea, mà phải thông qua con đường

khoáng hoá nhờ vi sinh vật để phân huỷ urea thành amoniac

(NH3, qúa trình amon hoá). Qúa trình amon hoá được tiến

hành với sự tham gia của nhiểu enzyme trong đó có urease

•  Trong y tế: Urease được ứng dụng để định lượng urea có

trong máu, nước tiểu góp phần chẩn đoán chức năng gan và

thận

•  (Tham khảo tài liệu gửi kèm)

40

3.1.3. Thu nhận Bromelain (EC 3.4.22.32, EC 3.4.22.33) từ dứa

EC 3.4.22.32

EC 3.4.22.33

41

Các bộ phận của dứa

42

Cấu trúc và đặc tính của bromelain

Vùng tương tác với các

phối tử (ligand, 40º A)

Trung tâm hoạt động (active site)

43

Cấu trúc và đặc tính của bromelain (tiếp)

•  Bromelain từ thịt quả có amino acid đầu N (N-Terminal, -NH2) là alanine và đầu C (C-Terminal, -COO) là glycine

•  Bromelain từ bộ phận của thân, vỏ, cuống có amino acid đầu N (N-

Terminal, -NH2) là valine và đầu C (C-Terminal, -COO) là glycine

44

Cấu trúc và đặc tính của bromelain (tiếp)

•  Trung tâm hoạt động có chứa cystein và hai sợi polypeptide

liên kết với nhau bằng cầu nối –S-S– (disulfur). Cầu –S-S– có

vai trò duy trì cấu trúc không gian của bromelain

•  Bromelain của thân cuống có thêm Zn2+ (2 mg/g bromelain) để

ổn định cấu trúc không gian của bromelain

Hai phân tử cystein tạo cầu

nối –S-S– (disulfur)

45

Cấu trúc và đặc tính của bromelain (tiếp)

•  Bromelain tan nhẹ trong nước và glycerine nhưng không tan

trong dung môi hữu cơ

•  Bromelain có hoạt tính khác nhau khi thuỷ phân cơ chất khác

nhau. Ví dụ, khi cơ chất là hemoglobin khả năng phân giải của

bromelain gấp 4 lần papain. Nếu cơ chất là casein thì khả

năng phân giải của 2 enzyme này là tương đương nhau. Đối

với các cơ chất tổng hợp thì khả năng phân giải của bromelain

yếu hơn papain

•  Bromelain thể hiện ở cả 3 hoạt tính: peptidase (?), amidase

(?), esterase (?). Hoạt tính esterase của bromelain mạnh hơn

papain và ficin

46

Một số phản ứng thuỷ phân xúc tác bởi bromelain

•  Hoạt tính protease

47

Một số phản ứng thuỷ phân xúc tác bởi bromelain

•  Hoạt tính amidase và esterase

48

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain

•  Ảnh hưởng của nhiệt độ:

•  Ảnh hưởng của pH:

•  (Tự đọc: Tham khảo bài báo gửi kèm và tham khảo CN

Enzyme của Đặng Thị Thu trang 56-61)

49

Quy trình tạo chế phẩm bromelain từ chồi, ngọn dứa

50

3.1.4. Thu nhận papain từ đu đủ

•  Papain (EC 3.4.22.2): Là enzyme cystein protease có mặt

trong nhiều bộ phận của đu đủ, nhưng chủ yếu có trong nhựa

đu đủ (quả xanh khoảng 10 tuần tuổi)

•  Papain thể hiện nhiều hoạt tính xúc tác như: endo- và

exopeptidase (?), aminopeptidase (?)

51

Một số hoạt tính xúc tác phản ứng của enzyme thuỷ phân protein

52

Cấu trúc và đặc tính của papain

Cấu trúc và trung tâm hoạt động của papain

53

Cấu trúc và đặc tính của papain

•  Phân tử papain có 345 amino acid. Trong đó, bao gồm trình tự

peptide tín hiệu (signal peptide, 1-18), tiền peptide (19-133), và

peptide trưởng thành (134-345)

•  Cấu trúc bậc 3 của papain bao gồm 2 vùng (domain) được tách biệt

rõ ràng tạo thành khe (cleft), đây chính là TTHĐ của papain. TTHĐ

được tạo thành bởi tam giác (bộ ba) xúc tác bao gồm cystein (cys

25), histidine (his 159) và asparagine (asn 175).

•  Cấu trúc của papain được ổn định bởi 3 cầu nối –S-S– (disulfur)

54

Cấu trúc và đặc tính của papain (tiếp)

•  Papain thể hiện hoạt tính xúc tác khi nhóm –SH ở dạng tự do.

Do vậy, khi có mặt cystein (?) nhóm –SH được phục hồi (khi

papain ở dạng không hoạt động) hoặc hàm tăng hoạt tính của

papapin (chất hoạt hoá)

•  Papain bì kìm hãm bởi các chất oxy hoá như (O2, O3,

H2O2...), các chất này phản ứng với nhóm –SH trong TTHĐ

của papain (?)

•  Papain bền trong dung môi hữu cơ, cấu hình không gian

không đổi trong dung dịch ethanol 70% hoặc urea 6-7 M

•  Papain là enzyme chịu nhiệt, nhiệt độ tối ưu từ 60–70º C

•  Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng (4.5–8.5)

•  Papain tinh thể có độ bền thấp hơn trong nhựa

55

Quy trình thu nhận papain từ đu đủ

•  Thu nhận nhựa đu đủ và thu nhận papain từ nhựa đu đủ

56

Quy trình thu nhận papain từ đu đủ

•  Nguyên liệu: Nhựa đu đủ, celite, NaOH, cát sạch, (NH4)2SO4,

NaCl

•  Thiết bị: Cối, thiết bị lọc, thiết bị lắng, thiết bị sấy

•  Thu nhận nhựa đu đủ: Điều kiện và một số lưu ý khi lấy nhựa

-  Cây đang sinh trưởng tốt, không bị sâu bệnh, thân cây mập mạp

-  Quả còn xanh, vỏ mịn, nên lấy nhựa ở quả có độ tuổi 10 tuần

-  Thời gian lấy nhựa sáng sớm, kết thúc vào giữa buổi sáng

-  Vào mùa khô nhựa ít, đặc, nồng độ enzyme cao

-  Vào mùa mưa nhựa nhiều, loãng, nồng độ protein thấp

57

Các bước tiến hành

• Dùng dao inox rạch vài đường dọc theo quả

• Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu (?)

• Bảo quản lạnh, tránh nhựa tiếp xúc với không

khí (?)

•  Sấy khô đến 5% độ ẩm

• Thu nhận papain

58

Thu nhận papain

•  Thu nhận papain bán tinh khiết: Chủ yếu dùng dung môi

hữu cơ để tinh sạch papain. Nhựa đu đủ (khô) được chiết

rửa 2,3 lần bằng cồn 90º, lọc lấy cặn, làm bay hơi cồn. Cặn

được hòa tan trong nước cất, sấy ở 30-40ºC. Thu nhận

papain, ngâm papain trong nước cất bổ sung acetone lạnh

(4º C, tỷ lệ 1:2). Ly tâm lạnh, thu kết tủa, sấy ở 45º C.

Nghiền thành bột

•  Thu nhận papain tinh khiết: Loại bỏ chất không tan, kết tinh

và sấy chân không (đông khô), thu papain

59

Một số đặc tính của chế phẩm papain thu được

•  Phân tử lượng: 27000 dalton

•  Bột màu vàng hay nâu tùy thuộc vào phương pháp sấy.

•  Không tan hầu hết trong các chất hữu cơ nhưng tan một

phần trong nước và glycerin.

•  Bền nhiệt.

•  (Tham khảo thêm tài liệu gửi kèm và tham khảo CN Enzyme

của Đặng Thị Thu trang 56-61)

60

3.2 Sản xuất enzyme động vật

•  3.2.1 Thu nhận pancreatin

•  3.2.2 Thu nhận pepsin

•  3.2.3 Thu nhận rennin

61

3.2.1 Thu nhận pancreatin (EC?)

•  Pancreatin là hỗn hợp của một số enzyme hệ tiêu hoá, bao

gồm amylase (EC 3.2.1.1), lipase (EC ?), protease (EC?).

Các enzyme này thường được sản sinh ra bởi tế bào ngoại

tiết của tuỵ tạng động vật

•  Pancreatin thường chứa hỗn hợp enzyme amylase, lipase,

trypsin (EC 3.4.21.4). Trong đó, amylase có nhiệm vụ thuỷ

phân tinh bột thành các oligosaccharide và disaccharide

(maltose), lipase thuỷ phân triglyceride thành acid béo và

glycerol, trypsin thuỷ phân protein thành các oligopeptide

•  Tỷ lệ các enzym này trong dịch tụy người không thay đổi

ngoại trừ một vài trường hợp thiếu hụt có chọn lọc của lipase

và trysinogen (tiền trypsin). Trong 1mg pancreatin có khoảng

25 đơn vị hoạt tính protease, trên 25 đơn vị hoạt tính amylase

và trên 2 đơn vị hoạt tính lipase.

62

Một số đặc tính của pancreatin

•  Pancreatin là nguồn bổ sung hữu hiệu khi cơ thể thiếu hụt

các enzyme tuyến tuỵ hoặc thay thế, hỗ trợ tiêu hoá khi cơ

thể không sản sinh nguồn enzyme này

•  Pancreatin là dạng bột vô định hình có màu xám nhạt hay

vàng nhạt, có mùi và vị đặc trưng, hòa tan trong nước và

không tan trong cồn và chloroform

•  Pancreatin có hoạt tính mạnh nhất trong môi trường kiềm và

bị bất hoạt trong môi trường acid mạnh (?) và nó hoạt động

mạnh nhất trong 2 - 3 giờ sau khi ăn thực hiện quá trình tiêu

hóa ở ruột non. Pancreatin có thể peptone hóa nhiều loại

thức ăn như sữa, thịt, cháo và chuyển hoá dầu, chất béo

thành dạng nhũ tương để dễ tiêu hóa

63

Hệ enzyme lipase và cơ chế phản ứng của lipase tuỵ tạng

•  Hệ enzyme lipase bao gồm lipase tuyến tuỵ, lipase gan, lipase

nội mô và lipoprotein lipase (EC 3.1.1.34)

64

Trypsin (EC 3.4.21.4): Cấu trúc và đặc tính

Cấu trúc và trung tâm hoạt động (active site) của trypsin

65

Trypsin (EC 3.4.21.4): Cấu trúc và đặc tính

•  Trypsin là một serine protease (serine đóng vai trò là một

amino acid ái nhân-nucleophile trong trung tâm hoạt động)

66

Trypsin (EC 3.4.21.4): Cấu trúc và đặc tính

•  Trypsin hoạt hoá chymotrypsin (EC 3.4.21.1, cũng được tổng

hợp ở tuỵ tạng dưới dạng tiền enzyme chymotrypsinogen)

•  Trypsin và chymotrypsin có tính đặc hiệu cơ chất khác nhau

(tra bảng trong chương 1, trang 27)

Qúa trình hính thành hoạt hoá của

Tính đặc hiệu cơ chất của trypsin

trypsin và chymotrypsin

và chymotrypsin

67

Trypsin (EC 3.4.21.4): Cấu trúc và đặc tính

•  Được tạo ra trong ruột non, trong khi dạng tiền enzyme của

nó (trypsinogen) được sản sinh trong tuỵ tạng. Dạng không

hoạt động trypsinogen sau đó di chuyển đến ruột non và

được hoạt hoá thành trypsin

•  Trung tâm hoạt động của trypsin bao gồm tam giác xúc tác là

Histidine-57, Aspartate-102, và Serine-195

•  Trypsin động vật có vú có nhiệt độ hoạt động tối ưu khoảng

37º C. Trypsin của một số loài cá có nhiệt độ hoạt động từ 4–

65º C

•  Trypsin có khối lượng phân tử khoảng 23.3 kDa

•  Trypsin hoạt động tốt trong môi trường kiềm, pH 8

•  (tham khao thêm các tài liệu khác)

68

Thu nhận pancreatin

Pancreatin có ở trong tụy của động vật máu nóng và thường

trích pancreatin tuỵ tạng của lợn (heo). Một số bước cơ bản

thu nhận pancreatin

•  Thu nhận pancreatin thô bằng phương pháp sấy: lấy tuỵ tươi

đã được bảo quản, trộn với tinh bột một lượng bằng 10% so

với trọn lượng tuỵ tươi

•  Sấy ở nhiệt độ 50º C, 60º C, 70º C. Sau một thời gian sấy thì

đem xay nhuyễn và được chế phẩm pacreatin thô

•  (Đọc thêm về quy trình, phương pháp khác thu nhận

pacreatin tinh khiết trong tài liệu gửi kèm)

69

3.2.2 Thu nhận pepsin (EC 3.4.23.1)

•  Cấu trúc và đặc tính của pepsin

Cấu trúc và trung tâm hoạt động của pepsin

70

Cấu trúc và đặc tính của pepsin

•  Pepsin chỉ có một mạch nên không có cấu trúc bậc 4

•  Pepsin là protease acid có trong màng nhầy dạ dày lợn. Trong

màng nhầy dạ dày, ban đầu pepsin ở dạng zymogen, thường

gọi là pepsinogen (dạng không hoạt động). Dưới tác dụng của

acid (HCl) có trong dịch vị, pepsinogen được hoạt hoá thành

pepsin

71

Cấu trúc và đặc tính của pepsin

•  Pepsin hoạt động mạng trong môi trường acid pH 1.5–2 và

nhiệt độ 37º C–42º C

•  Pepsin bị vô hoạt trong môi trường kiềm

•  Pepsin chỉ phân cắt tại vị trí có các amino acid kỵ nước, chứa

vòng thơm (tra bảng trang 27, chương 1). Ví dụ vị trí cắt của

pepsin trên chuỗi B của insulin

72

Quy trình thu nhận pepsin

Xử lý

Nguyên liệu

(rửa)

(màng nhầy dạ dày, mucosa)

Nghiền

Tự phân

(HCl 5%)

Gạn, lọc

dịch tự phân

Kết tủa

(NaCl 22%)

Tách tủa

Bổ sung

chất ổn định

Sấy

(38-40ºC)

Chế phẩm pepsin

73

3.2.3 Thu nhận rennin (chymosin, EC 3.4.23.4)

•  Là protease có tính acid có trong dạ dày của động vật nhai

lại, thường được sản sinh trong dịch tiêu hoá của dạ dày bê

(dưới 5 tháng tuổi). Khi bê lớn dần hàm lượng rennin giảm

dần và được thay thế bằng pepsin

•  Dạng tiền enzyme (bất hoạt hay không hoạt động) của rennin

là prorennin (prorenin), dưới tác dụng của môi trường acid

dạng prorennin được hoạt hoá thành rennin

•  Điểm đẳng điện pI 4.5

•  Cấu trúc và đặc tính của rennin

74

Cấu trúc và đặc tính của rennin

•  Có trọng lượng phân tử khoảng 33-34

kDa

•  Rennin chứa nhiều amino acid có tính

acid hơn amino acid kiềm tính (nhưng

thấp hơn pepsin?)

Cấu trúc của rennin

TTHĐ của rennin (bò)

TTHĐ của rennin (lạc đà )

75

Cấu trúc và đặc tính của rennin (tiếp)

•  Rennin được sử dụng làm tủa và hình thành các cục đông

trong sản xuất phomai (fromage)

•  Rennin tác dụng đặc hiệu lên các liên kết được tạo bởi

tyrosine và phenylalanine tạo mùi vị đặc trưng cho phomai

•  Glutamate (glutamic acid) và aspartate (aspartic acid) trên

phân tử rennin tương tác với histindine trên k-casein hình

thành liên kết giữa enzyme và cơ chất.

•  Rennin phân cắt kết peptide giữa phenylalanine (105) và

methionine (106) của k-casein tạo ra sản phẩm calcium

phosphocaseinate

•  Ca2+ hoạt hoá rennin, trong khi urea làm bất hoạt rennin (?)

76

Thu nhận rennin

•  Nguyên vật liệu: NaCl, HCl (tủa enzyme), Na-benzoate (chất

bảo quản), ngăn thứ tư dạ dày bê non (dạ múi khế) < 5

tháng tuổi

•  Thiết bị: Máy điều nhiệt, ly tâm, máy quang phổ kế, máy

đồng hoá, dụng cụ đo pH...

•  Quy trình thu nhận rennin gồm 2 giai đoạn: Thu nhận dịch

rennet (chứa rennin) và thu nhận rennin

77

Giai đoạn 1: Thu nhận dịch rennet

•  Xử lý sơ bộ: tách mỡ, rửa qua, lấy phần múi khế của bao tử

bê, lộn ngược để loại bỏ thức ăn dư thừa, tách mỡ, rửa qua

bằng nước lạnh, sau đó rửa bằng nước muối NaCl 5%

•  Xay nhuyễn (đồng nhất), trích ly (bổ sung NaCl 10% và HCl

0.2%, boric acid 0.7%, chỉnh pH 2-3?), giữ mẫu 35-40º C

trong 30 h, thêm HCl 6M chỉnh pH 4, pH 4.5?

•  Lọc: vớt bỏ lớp mỡ trên bề mặt, lọc bằng vải màn thu được

dịch rennet chứa rennin

•  Bảo quản enzyme bằng cách bổ sung NaCl 15-20% và Na-

benzoate 1%

78

Giai đoạn 2: Thu nhận rennin từ dịch chiết

•  Tủa dịch rennet bằng phương pháp diêm tích: cho từ từ NaCl

tinh thể vào dung dịch (nồng độ 22-25%), khuấy nhẹ, để 4º C/

20 phút

•  Ly tâm dịch tủa tại 5000 v/phút trong 45 phút, thu được rennin

thô (muối, enzyme protein lạ và enzyme tinh khiết)

•  Làm khô tủa tại nhiệt độ phòng

•  Tinh sạch rennin thô: bằng phương pháp màng bán thấm

(cel ophane) hoặc sắc ký DEAE sephadex G-50

-  Phương pháp màng bán thấm: phương pháp thẩm tích qua màng bán

thấm. Túi thẩm tích chứa dịch chiết enzyme, được đặt vào trong dung

dịch đệm không chứa chất hoà tan (ví dụ muối, chất có phân tử nhỏ)

cần loại bỏ, chất hoà tan khuếch tán khỏi màng theo chiều gradient

nồng độ, khi nồng độ chất tan bên trong và ngoài màng bằng nhau, cần

thay dung dịch đệm mới

-  Sắc ký DEAE sephadex G-50 (lọc gel)

79

pH tối ưu và chất hoạt hoá một số protease động vật

80

Đặc điểm chung TTHĐ của nhóm enzyme thuỷ phân

•  Chứa tam giác xúc tác bao gồm 3 amino acid: Là các amino

acid mang tính acid, base (kiềm) và nucleophile (ái nhân)

81

Đặc điểm chung TTHĐ của nhóm enzyme thuỷ phân

(xem lại bảng liệt kê phân loại 21 amino

acid chương 1, trang 27)

82

Tóm lược quy trình tổng quát thu nhận enzyme từ động, thực vật và vi sinh vật

83

So sánh khả năng thu nhận enzyme từ các nguồn khác nhau

(động, thực vật và vi sinh vật)

•  Không thể thu enzyme từ động vật ở quy mô công nghiệp vi

thời gian nuôi dài và không kinh tế

•  Thu nhận enzyme từ thực vật cũng không kinh tế vì tốn diện

tích đất canh tác, mất nhiều công chăm bón, chăm sóc, đặc

biệt khi có thiên tai hoặc mùa màng không thuận lợi do yếu tố

thời tiết

•  Thu nhận enzyme từ vi sinh vật rất phong phú, có khả năng

sinh tổng hợp các enzyme từ nguồn thực vật, động vật hoặc

một enzyme nào đó theo ý muốn (cải biến enzyme). Do thời

gian sinh sản và phát triển ngắn, nên tốc độ sinh tổng hợp

enzyme rất lớn. Thêm vào đó, các điều kiện nuôi cấy vi sinh

có thể điều khiển được nên hoàn toàn có thể sản xuất enzyme

ở quy mô công nghiệp.

84

Kết thúc chương 3