1. Lai khuẩn lạc và vết tan

DNA được tạo dòng trong plasmid hoặc YAC sản xuất ra các khuẩn lạc khi các nuôi cấy biến nạp được dàn mỏng trên đĩa agar chứa môi trường sinh trưởng và nuôi cấy dưới những điều kiện thích hợp. Các bacteriophage sinh tan tế bào bị chúng xâm nhiễm và sản xuất ra các plaque (vết tan) có dạng hình tròn chu vi khoảng 2-3 mm có màu sáng trên thảm vi khuẩn (bacterial lawn) của lớp agar đỉnh (trong trường hợp này người ta chuẩn bị đĩa agar có hai lớp: lớp agar đỉnh có nồng độ agar thấp để bacteriophage dễ sinh tan tế bào vi khuẩn, và lớp agar đáy có nồng độ agar cao hơn).

Các vector, như mô tả ở trên, thường chứa gen chỉ thị cho phép chọn lọc những tế bào vật chủ mang vector (thể biến nạp). Các chỉ thị này thường là gen kháng kháng sinh và các tế bào biến nạp sinh trưởng trên môi trường chứa kháng sinh tương ứng.

Ngoài ra, các vector còn chứa các gen chỉ thị bổ sung để phân biệt các tế bào biến nạp chứa đoạn chèn của DNA ngoại lai với các tế bào chứa các vector tự tái tạo lại vòng. Ví dụ: gen lacZ mã hóa enzyme β-galactosidase.

Một dòng (clone) chứa các chuỗi DNA quan tâm đặc biệt có thể được xác định bởi lai khuẩn lạc hoặc vết tan. Một lượng nhỏ khuẩn lạc biến nạp hoặc vết tan được chuyển lên màng nitrocellulose hoặc nylon bằng cách phủ (overlay) màng này lên trên đĩa agar. DNA được biến tính và cố định trên màng bằng đun nóng (baking) hoặc chiếu tia cực tím (UV-crosslinking), và sau đó được lai trong đệm chứa probe đã đánh dấu đồng vị phóng xạ có trình tự bổ sung một phần của chuỗi được xác định. Ví dụ: Có thể một oligonucleotide tổng hợp nhân tạo, có nguồn gốc từ genomic DNA từng phần, cDNA hoặc trình tự protein hoặc sản phẩm PCR. Trong một vài trường hợp, probe có thể được thiết kế dựa trên trình tự bắt nguồn từ gen tương đồng của các loài khác và thường được lai với cường lực thấp. Các probe thừa được rửa khỏi màng để ủ với phim X-quang. Theo hướng của phim (sau khi rửa) so sánh với đĩa agar gốc, sau đó sẽ có khả năng gắn kết các khuẩn lạc thực tế với các khuẩn lạc lai dương tính tương ứng trên phim X-quang.

2. Sàng lọc thư viện gen bằng PCR

PCR (polymerase chain reaction) cũng có thể được ứng dụng để sàng lọc các thư viện genomic DNA hoặc cDNA được xây dựng trong các plasmid vector hoặc bacteriophage vector. Ưu điểm chính của sàng lọc bằng PCR so với sàng lọc dựa trên lai truyền thống là ít tốn thời gian hơn. Sàng lọc bằng PCR có thể được đảm bảo trong 3-4 giờ trong khi đó nó có thể mất một vài ngày trước khi phát hiện bằng kỹ thuật lai phân tử (molecular hybridization). Kỹ thuật sàng lọc bằng PCR thể hiện chỉ thị về kích thước của các đoạn chèn DNA được tạo dòng hơn là trình tự của đoạn chèn, tuy nhiên các primer PCR đặc trưng cho đoạn chèn DNA ngoại lai cũng có thể được sử dụng. Điều này cho phép khảo sát chính xác hơn đặc điểm của các dòng từ thư viện cDNA và genomic DNA.

▪ Nguyên tắc của PCR

PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến vô cùng quan trọng tương đương với việc khám phá ra các enzyme hạn chế và kỹ thuật Southern blot.

Kỹ thuật PCR dựa trên cơ sở phản ứng mở rộng primer nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại in vitro các nucleic acid đặc trưng. PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài khoảng từ 200-3.000 bp. Đoạn DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận diện nhờ cặp primer đặc trưng (oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide.

Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus) được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi trường có 4 loại deoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu. Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn DNA nói trên được nhân lên gấp nhiều lần, nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng... Primer ở bên trái tác động trên sợi DNA 3’-5’ được gọi là primer thuận (forward primer-ký hiệu là F). Primer ở bên phải tác động trên sợi DNA 5’-3’ được gọi là primer ngược (reverse primer-ký hiệu là R).

Nguyên tắc của PCR được trình bày trong hình 9.12. Theo đó, từ chu kỳ thứ hai Taq polymerase bắt đầu tạo ra các đoạn DNA có chiều dài xác định. Các primer thường là một oligonucleotide tổng hợp (synthetic oligonucleotide) có khoảng 10-20 nucleotide hoặc dài hơn. Nếu biết trình tự của đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer tương ứng để thực hiện PCR và tách chúng ra bằng kỹ thuật điện di. PCR thường tiến hành khoảng 25-35 chu kỳ, qua đó từ 10-6 g DNA ban đầu có thể khuếch đại (amplification) lên tới trên 1 g (khoảng 2 kb). Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:

- Gây biến tính (denaturation) ở 90-95oC. Trong giai đoạn biến tính phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn (single strands).

- Gắn primer (annealing) ở 40-65oC. Trong giai đoạn này các primer gắn vào các vị trí có trình tự tương đồng ở DNA khuôn mẫu. Các liên kết ion tạo thành một đoạn nhỏ (các primer đã lắp ráp chính xác) và trên các đoạn nhỏ DNA sợi đôi đó (khuôn mẫu và primer) enzyme Taq polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu.

- Kéo dài phân tử (extension) ở 70-72oC. Đây là khoảng nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bắt đầu từ các vị trí có primer theo chiều 5’3’.

3. Sàng lọc các thư viện cDNA bằng các probe khác nhau

Sàng lọc thư viện cDNA bằng cách lai nucleic acid là phương pháp được sử dụng phổ biến và đáng tin cậy nhất để tìm kiếm các dòng quan tâm. Sàng lọc bằng phương pháp lai nucleic acid cho phép phân tích đồng thời nhiều dòng và nhanh, không đòi hỏi các dòng cDNA phải hoàn chỉnh và sản phẩm được tổng hợp trong tế bào vật chủ phải có hoạt tính sinh học hoặc kháng nguyên. Hơn nữa, cơ sở lý thuyết của kỹ thuật lai nucleic acid đã được hiểu biết đầy đủ. Điều này cho phép phát triển một số lượng lớn các kỹ thuật khác nhau có thể điều chỉnh các probe của nucleic acid có các chiều dài và đặc điểm khác nhau.

- Các probe tương đồng. Các probe tương đồng chứa ít nhất một phần của chuỗi nucleic acid chính xác của dòng cDNA quan tâm. Chúng được dùng trong nhiều trường hợp khác nhau, ví dụ: khi một dòng bộ phận của cDNA hiện có được sử dụng để phân lập một dòng hoàn chỉnh từ thư viện cDNA. Thông thường, đoạn bắt nguồn từ một đầu hoặc đầu kia của dòng hiện có được phân lập, đánh dấu phóng xạ in vitro và dùng để thăm dò thư viện. Lai với các probe tương đồng thường được tiến hành dưới các điều kiện nghiêm ngặt.

- Các probe tương đồng từng phần. Các probe tương đồng từng phần được dùng để phát hiện các dòng cDNA có quan hệ họ hàng, nhưng không giống hệt nhau hoàn toàn, với các trình tự của probe.

- Các probe oligonucleotide nhân tạo.Các probe oligonucleotide nhân tạo là các vùng dNTP của trình tự xác định được tổng hợp in vitro. Trình tự của các probe này được suy luận, bằng cách dùng mã di truyền, từ các vùng ngắn của chuỗi amino acid đã biết của protein quan tâm. Do sự thoái biến của mã di truyền3, chuỗi amino acid đề xuất có thể không được đặc trưng chính xác bởi các oligonucleotide đơn được dự đoán cho trình tự. Mặc dù, trong rất nhiều trường hợp, trình tự các amino acid giống nhau có thể được đặc trưng bởi nhiều oligonucleotide khác nhau.

4. Phân tích genomic DNA bằng phương pháp lai Southern

Việc phát hiện và xác định các chuỗi nucleic acid đặc trưng là công việc thường xuyên trong nghiên cứu sinh học phân tử. Nguyên tắc của kỹ thuật này là dựa vào sự lai phân tử, dưới các điều kiện thích hợp hai chuỗi nucleic acid đơn tạo thành một phân tử lai. Phản ứng lai phụ thuộc rất nhiều vào mức độ tương đồng của hai chuỗi nucleotide. Việc tạo thành phân tử sợi đôi như thế xảy ra chủ yếu thông qua liên kết hydrogen giữa các base guanosine với cytosine, và adenosine với thymidine. Thành phần và sự phân bố của các base không giống rõ rệt với các phân tử nucleic acid cho kết quả các tính chất lai khác nhau, vì thế liên kết hydrogen (hoặc lai phân tử giữa các base tương đồng) khi được ghép cặp thích hợp đã cung cấp một công cụ có giá trị để xác định các chuỗi liên quan hoặc đồng nhất với chuỗi nucleic acid quan tâm (probe).

Trong số các kỹ thuật khác nhau sử dụng lai phân tử để phân tích nucleic acid, thì kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất là lai mẫu dò nucleic acid được đánh dấu với nucleic acid đích được cố định trên một vật đỡ rắn, đặc trưng là màng nitrocellulose hoặc nylon.

Trình tự của kỹ thuật lai Southern blot bao gồm các bước sau: phân tách các đoạn cắt hạn chế của DNA hệ gen bằng điện di agarose gel, chuyển DNA từ agarose gel lên màng lai, lai các mẫu dò được đánh dấu đồng vị phóng xạ với các nucleic acid được cố định trên màng lai (Hình 9.13).

Các thí nghiệm lai trên màng thường được tiến hành bằng cách đánh dấu probe bằng 32P (mặc dù các đồng vị phóng xạ khác như 35S cũng có thể được sử dụng). Phản ứng lai của Southern đòi hỏi hoạt tính đặc hiệu của probe tối thiểu phải là 109 dpm/μg, mặc dù hoạt tính 108 dpm/μg có thể được xem như là chấp nhận được trong các ứng dụng cần cường lực thấp. Các phương pháp không dùng đồng vị phóng xạ (ví dụ: digoxigenin-dUTP) ngày càng được sử dụng phổ biến hơn mặc dù độ nhạy của chúng là không lớn. Nhưng các kỹ thuật không dùng đồng vị phóng xạ an toàn hơn cho nghiên cứu viên, tạo ra các probe có thể được bảo quản trong thời gian dài trước khi dùng và kết quả phát hiện các tín hiệu lai nhanh hơn.