Các phương thức cơ bản của kỹ thuật DNA tái tổ hợp là: (1) Gắn một đoạn DNA vào một phân tử DNA (như là vector) có thể tái bản, và (2) cung cấp một môi trường cho phép sao chép phân tử DNA đã được gắn.

Có ba nhóm vector được dùng phổ biến để tạo dòng các đoạn DNA ngoại lai và tái bản (sao chép) trong E. coli; đó là plasmid, bacteriophage  và cosmid. Tất cả những vector này phải có một số tính chất cần thiết sau:

- Chúng có khả năng tự tái bản trong E. coli.

- Mang các gen chỉ thị chọn lọc để dễ dàng phân biệt và tinh sạch vector của thể tái tổ hợp với các dạng khác.

- Chúng có các vùng DNA không cần thiết cho sự sinh sản trong vi khuẩn, vì thế DNA ngoại lai có thể được đưa vào trong các vùng này.

- Chúng có thể biến nạp vào tế bào vật chủ một cách dễ dàng.

1. Plasmid vector

Plasmid là các thông tin di truyền ngoài nhân có trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Chúng là những phân tử DNA mạch vòng, sợi đôi, kích thước từ 1-  200 kb, có khả năng tự sao chép để tồn tại độc lập trong tế bào. Các plasmid có thể mang một số gen của vi khuẩn và các gen này có thể biểu hiện ra protein.

Plasmid mang các gen mã hóa cho các enzyme thường có lợi cho vi khuẩn vật chủ. Các plasmid có thể mang các kiểu hình khác nhau như: kháng kháng sinh, sản xuất kháng sinh, phân hủy các hợp chất hữu cơ phức tạp, sản xuất các enzyme hạn chế và enzyme biến đổi (modification enzymes).

Các plasmid có thể được chuyển vào trong vi khuẩn sau khi vi khuẩn được xử lý để tế bào có thể cho thấm qua nhất thời đối với các phân tử DNA nhỏ. Quá trình này được biết như là sự biến nạp (transformation). Vi khuẩn được biến nạp thành công có thể được chọn lọc dựa trên kiểu hình mới mà chúng nhận được từ plasmid, chẳng hạn khả năng kháng các kháng sinh.

Một số plasmid hiện diện trong tế bào có số bản sao thấp, một hoặc một vài bản sao trên tế bào, do DNA của plasmid chỉ sao chép một hoặc hai lần trước khi tế bào phân chia. Tuy nhiên, các plasmid khác tồn tại một số bản sao lớn hơn (10 tới 100 bản sao trên một tế bào) do DNA tái bản lặp lại cho đến khi đạt được số bản sao thích hợp. Các plasmid có số bản sao lớn được gọi là plasmid dạng xoắn lỏng lẻo (relaxed plasmid), và đây là một trong những tính chất hữu ích của vector tạo dòng.

Số thứ tự của các nucleotide trên vector được bắt đầu với vị trí EcoRI đơn: T đầu tiên trong chuỗi GAATTC được quy ước là nucleotide thứ nhất. Các số thứ tự sau đó được tiếp tục quanh phân tử vector theo hướng từ gen kháng tetracycline tới gen kháng ampicillin.

Plasmid có thể được cắt ở một vị trí xác định bằng enzyme hạn chế. Vì thế, các đoạn được tạo ra có thể tạo vòng bằng cách kết hợp các đầu dính bổ sung. Hơn nữa, các đoạn được tạo ra bởi một enzyme đặc biệt hoạt động trên một phân tử DNA sẽ có đầu tương đồng (đầu dính) với đoạn được tạo ra bởi cùng một enzyme hoạt động trên một phân tử DNA khác. Vì thế, các đoạn từ hai phân tử DNA khác nhau, từ hai cơ thể khác nhau có thể kết hợp bằng các liên kết hydrogen thuận nghịch khi các đoạn này được trộn lại.

Nếu sự kết hợp được gắn lại sau khi bắt cặp, thì các đoạn được kết hợp cố định bền vững, sự kết hợp của các đoạn này được thực hiện nhờ enzyme DNA ligase (còn gọi là polynucleotide ligase) liên kết cộng hóa trị các phân tử tái tổ hợp bằng cách tạo ra liên kết phosphodiester giữa nhóm 5’-PO4 của polynucleotide này với nhóm 3’-OH của polynucleotide khác.

2. Bacteriophage  vector

Các bacteriophage có nhiều ưu điểm khi được sử dụng làm vector tạo dòng. Vector dược sử dụng rộng rãi nhất là bacteriophage  để gây nhiễm vào tế bào E. coli. Một trong những ưu điểm chính của phage  là có hiệu quả chuyển DNA vào trong tế bào vi khuẩn cao. Ưu điểm thứ hai là một phần ba của genome phage  là không cần thiết cho sự xâm nhiễm và sinh sản của nó trong tế bào vật chủ, không có những gen này, một tiểu thể  vẫn chuyển thành công DNA của nó vào vi khuẩn và sinh sản được. Các gen không cần thiết này, khoảng >15 kb, có thể được thay thế bằng một đoạn DNA ngoại lai khoảng 15-23 kb. Ưu điểm thứ ba là DNA sẽ không bị đóng gói trong vỏ  trừ khi nó dài từ 40-50 kb; vì thế các đoạn DNA ngoại lai không bao giờ được chuyển vào tế bào trừ khi chúng được chèn vào trong genome phage , điều kiện cần thiết để đảm bảo đoạn DNA ngoại lai sẽ được tái bản sau khi nó vào trong tế bào vật chủ.

Các gen cần thiết của genome phage  được định vị trong một cụm. Các chủng của phage , được gọi là vector thay thế, đã được biến đổi di truyền với một vị trí RE duy nhất cho EcoRI (chủng phage  thế hệ mới EMBL 3 có ba vị trí cho các RE: EcoRI, BamHI và SalI) trên một mặt khác của các gen không cần thiết (Hình 9.6). Vì thế, có thể loại bỏ các gen không cần thiết bằng EcoRI. DNA ngoại lai được cắt bằng EcoRI sẽ có đầu dính bổ sung cho đầu của các đoạn DNA của phage  cần thiết (nhánh trái và phải), để có thể được kết nối bằng DNA ligase. Genome của phage  có các đoạn sợi đơn ngắn được gọi là các vị trí cos cần cho sự đóng gói DNA trong đầu của phage. Genome tái tổ hợp của phage  sau đó có thể được đóng gói trong vỏ protein và được bổ sung vào trong E. coli. Các phage  gây ra sự xâm nhiễm DNA tái tổ hợp của chúng vào trong tế bào vật chủ, nơi nó sẽ được tái bản. Chỉ các đoạn DNA có kích thước thích hợp và mang các gen cần thiết được đóng gói trong các vỏ của phage, cung cấp một hệ thống chọn lọc tự động cho các vector tái tổ hợp.

3. Cosmid vector

Các vector phage  chỉ có thể mang các đoạn DNA có kích thước khoảng 15-23 kb. Tuy nhiên, các cosmid vector lại mang được các đoạn DNA có kích thước lớn hơn nhiều, khoảng 45 kb.

Cosmid là các plasmid nhỏ mang các vị trí cos của phage; chúng có thể được đóng gói trong vỏ virus và được chuyển vào vi khuẩn nhờ sự xâm nhiễm của virus. Do tất cả các gen virus, ngoại trừ các vị trí cos, là không có, nên cosmid có thể mang các đoạn DNA ngoại lai lớn hơn hai lần các đoạn mà phage  vector có thể mang. Các cosmid vector có các thành phần sau: (1) một điểm khởi đầu sao chép của plasmid (ori); (2) một số các vị trí cắt hạn chế đơn; (3) một hoặc hơn các gen chỉ thị chọn lọc; và (4) các vị trí cos cho phép đóng gói DNA trong đầu của phage.

DNA ngoại lai được chèn vào trong cosmid trong cùng một phương thức với plasmid: cosmid và DNA ngoại lai đều được cắt bởi cùng một RE để tạo ra các đầu bổ sung (đầu dính), và chúng được liên kết với nhau bằng DNA ligase. Các cosmid tái tổ hợp được hợp nhất trong vỏ, và các tiểu thể phage được sử dụng để xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn, ở đó cosmid sẽ tái bản như một plasmid. Bảng 9.2 so sánh các tính chất của các vector plasmid, phage  và cosmid.

4. Thư viện cDNA

Thư viện cDNA (complementary DNA) là tập hợp các đoạn DNA bổ sung (cDNA) được tổng hợp từ mRNA của một bộ phận trong cơ thể sinh vật. Sử dụng thư viện cDNA có hai ưu điểm sau:

- Các dòng cDNA chứa trình tự mã hóa liên tục của một gen.

- Nhiều protein được tổng hợp với số lượng lớn do những tế bào chuyên hóa và như vậy trong các tế bào này mRNA của protein đó sẽ có tỷ lệ cao và thư viện cDNA được tạo ra từ các tế bào này sẽ có nhiều cDNA mã hóa cho các protein tương ứng. Sự dồi dào cDNA của một vài loại nào đó đã làm giảm nhẹ đáng kể việc xác định đúng dòng mong muốn từ thư viện gen.

Phương pháp tổng hợp gen từ mRNA ngày càng được phát triển, nó kết hợp với các phương pháp khác của sinh học phân tử cho phép ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.

Xây dựng một thư viện cDNA bao gồm năm bước chính sau:

- Tinh sạch mRNA từ RNA tổng số của một phận cơ thể sinh vật.

- Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất từ khuôn mẫu mRNA nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase).

- Gây biến tính (đun sôi) thể lai mRNA-cDNA để phá hủy sợi mRNA bằng RNase H của E. coli. Tổng hợp sợi cDNA thứ hai từ khuôn mẫu sợi cDNA thứ nhất nhờ enzyme DNA polymerase với primer là vòng cặp tóc của nó để thu được phân tử cDNA sợi đôi.

- Cắt vòng cặp tóc bằng enzyme nuclease S1 và dùng enzyme Klenow sửa chữa hai đầu của sợi đôi cDNA để tạo ra đầu bằng.

­- Gắn các đoạn nối (linker) vào hai đầu của cDNA sợi đôi trước khi tạo dòng trong vector thích hợp để xây dựng thư viện cDNA.

5. Thư viện genomic DNA

Thư viện genomic DNA là một tập hợp các đoạn DNA cùng đại diện cho một genome nguyên vẹn (hoặc gần nguyên vẹn) của cá thể mà DNA được bắt nguồn từ đó.

Xây dựng một thư viện genomic DNA bao gồm bốn bước chính: Cắt DNA, gắn DNA vào vector, đóng gói các dòng tái tổ hợp trong vỏ protein của virus để làm bước trung gian trước khi xâm nhập vào tế bào vật chủ, và chuyển cấu trúc đó vào tế bào vật chủ.

Thư viện genomic DNA có nhiều ứng dụng, chẳng hạn để lập bản đồ vật lý (physical mapping) của DNA và xác định các gen gây bệnh hoặc các chuỗi DNA quan tâm cho những phân tích khác.

Sản xuất ra các dòng mang các đoạn chèn DNA khác nhau nhưng gối lên nhau có nhiều thuận lợi và thư viện có thể được sử dụng trong quá trình chromosome walking.

Các thư viện genomic DNA cũng cần thiết cho việc xác định các gen gây bệnh bằng cách tạo dòng chức năng (functional cloning). Theo hướng này, thông tin về chức năng của gen được khai thác để phân lập gen mong muốn từ thư viện. Một oligonucleotide có trình tự dựa trên chuỗi amino acid từng phần được dùng như là một probe (mẫu dò) để phân lập dòng cDNA bằng cách sàng lọc thư viện cDNA. Dòng cDNA này sau đó có thể được dùng để sàng lọc thư viện genome nhằm phân lập các dòng genomic DNA và cho phép khảo sát đặc điểm của chuỗi genomic hoàn chỉnh.