Trong tự nhiên, các enzyme endonuclease hạn chế (restriction endonuclease, RE), gọi tắt là enzyme hạn chế, hiện diện trong hầu hết các tế bào vi khuẩn để ngăn cản DNA ngoại lai tiếp quản bộ máy tổng hợp protein của tế bào. DNA của chính chúng sẽ được bảo vệ khỏi tác dụng của enzyme hạn chế nhờ sự có mặt của các enzyme nội bào có thể methyl hóa (methylation) các nucleotide đặc biệt, vì thế các nucleotide này không được nhận biết bởi các enzyme hạn chế.

Hiện nay, các enzyme hạn chế được phân lập từ các sinh vật prokaryote.

Mỗi enzyme hạn chế chỉ nhận biết và cắt một trình tự DNA đặc biệt thường chứa bốn hoặc sáu cặp nucleotide. Có hơn 900 enzyme hạn chế khác nhau được tinh sạch từ khoảng 250 chủng vi sinh vật. Các enzyme hạn chế cắt các phân tử DNA sợi đôi theo hai cách khác nhau (Hình 9.1):

- Cắt trên một đường thẳng đối xứng để tạo ra các phân tử đầu bằng (đầu thô).

- Cắt trên những vị trí nằm đối xứng quanh một đường thẳng đối xứng để tạo ra những phân tử đầu so le (đầu dính).

Vì một enzyme hạn chế chỉ nhận biết một trình tự duy nhất, cho nên số vị trí cắt trên một phân tử DNA đặc biệt thường là nhỏ. Các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách theo kích thước bằng điện di agarose gel để nghiên cứu. Do sự tương tự của tổ chức phân tử trong tất cả các cơ thể, cho nên DNA vi khuẩn, DNA thực vật và DNA động vật có vú tương hợp nhau về cấu trúc. Vì thế, một đoạn DNA từ một dạng sống này có thể dễ dàng được pha trộn với DNA của một dạng sống khác. Sự tương tự này cũng phù hợp đối với plasmid, nhân tố di truyền ngoài nhân được tìm thấy trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Chúng là những phân tử DNA mạch vòng đóng sợi đôi được dùng làm vector mang các đoạn DNA ngoại lai dùng trong kỹ thuật tái tổ hợp DNA.

Giống như EcoRI, nhiều enzyme hạn chế đã tạo ra các đoạn DNA với đầu 5’ lồi (protruding). Một số enzyme hạn chế (ví dụ: PstI) đã tạo ra các đoạn DNA có đầu 3’ lồi. Một số enzyme hạn chế khác (ví dụ: BalI) cắt ở trục đối xứng để tạo ra các đoạn DNA mang đầu bằng (blunt) (Bảng 9.1).

1. Gắn các đầu bị cắt bởi enzyme hạn chế

Có hai kiểu gắn khác nhau: gắn đầu bằng và gắn đầu dính, bằng cách dùng enzyme DNA ligase của bacteriophage T4 có thể gắn các đầu bằng hoặc đầu dính lại với nhau, tuy nhiên trường hợp đầu bằng thường cho hiệu quả thấp hơn đầu dính.

2. Isochizomer

Nói chung, các RE khác nhau nhận biết các trình tự khác nhau (Bảng 9.1), tuy nhiên cũng có một số trường hợp cho thấy có những enzyme được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau nhưng lại cắt trong một trình tự, các enzyme đó được gọi là isochizomer. Hơn nữa, một vài enzyme nhận biết các chuỗi tetranucleotide mà trong một số trường hợp các tetranucleotide này lại xuất hiện trong các chuỗi hexanucleotide của các enzyme khác.

Ví dụ:

- MboI và Sau3A nhận biết trình tự:

- Trong khi đó BamHI nhận biết trình tự:

Trong một vài trường hợp các đoạn được tạo ra nhờ một enzyme hạn chế này khi gắn với các đoạn được tạo ra nhờ một enzyme hạn chế khác đã hình thành các thể lai mà các enzyme bố mẹ không thể nhận biết được. Ví dụ: SalI cắt trình tự (GTCGAC) và XhoI cắt trình tự (CTCGAG), các trình tự được sinh ra này đã gắn với nhau tạo thành thể lai (hybrid) mà các vị trí cắt hạn chế của chúng không thể nhận biết bởi các enzyme SalI và XhoI: